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1、核酸提取纯化常见问题解答1.AccuPrep ? 凝胶回收试剂盒常见问题2.AccuPrep ? 基因组 DNA 提取试剂盒常见问题3.AccuPrep4.AccuPrep?GMO 提取试剂盒常见问题PCR 纯化试剂盒常见问题5.AccuPrep ? 质粒提取试剂盒常见问题6.AccuPrep ? 粪便 DNA 提取试剂盒常见问题7.AccuPrep ? 病毒 RNA 提取试剂盒常见问题8.琼脂糖凝胶回收和PCR 纯化常见问题9.质粒 DNA 提取操作常见问题AccuPrep?凝胶回收试剂盒TOPQ1.产量低A1. 1）凝胶不完全溶化会导致 DNA 产量的降低。离液盐不足不仅会导致凝胶溶化不完
2、全，DNA 被包裹不能释放到溶液中，而且还降低柱子对DNA 的亲和力，最终导致 DNA 产量降低。2）加入等量的无水乙醇到 W 缓冲液中了吗 ? 过浓的 W 缓冲液会将 DNA 洗脱，从而导致产量的降低。3）错误的洗脱缓冲液会降低产量 . 洗脱缓冲也不能包含过多的盐 . 缓冲液的 pH 应调至 7.0-8.5 。4）错误的结合条件例如 pH 过高会导致产量的降低 GB 缓冲液含有 pH 指示剂，当颜色为黄色时表示 pH在正常范围内。如果颜色为红色或橘黄色，表示pH 已经超出了正常的范围。这时应该加入几滴醋酸钠溶液去调整 pH 值到正常范围内。5）放入了过多的琼脂糖凝胶块。如果放入了超过400m
3、g 的琼脂糖凝胶块可能会降低DNA 结合柱的吸附力，从而导致 DNA 产量的降低。Q2 琼脂糖凝胶样品悬浮在溶液中A2. 琼脂糖凝胶样品悬浮在溶液中，这可能是因为样品中含有WB 缓冲液。 WB 缓冲液中的乙醇会导致悬浮，这种情况下离心样品三次。 如果悬浮的状况依然存在， 那么打开盖子空气中放置10 分钟挥发乙醇，再离心一次。Q3 提纯后的后续酶反应效率降低A3. 1) 样品中高浓度的盐抑制了酶的活性。这种情况下，加入W 缓冲液到结合柱后放置结合柱5 分钟，然后再离心。2) 样品中含有残留的WB缓冲液，残留的乙醇会抑制后续的酶反应，结合柱必须要完全晾干。如果问题仍然存在, 第二次离心后让结合柱晾
4、干10 分钟。 3 ）一起被洗脱的玻璃纤维影响了酶的活性，再离心 1 分钟，转移上清液到一个新的离心管中。AccuPrep?基因组DNA提取试剂盒TOPQ1. DNA产量或纯度低A1. 1）缓冲液或其他试剂暴露在不合适的条件下，导致了效率降低。确保试剂到货后存放于室温 (15-25 )，试剂使用后瓶盖要拧紧，保持其pH 值及稳定性，避免污染。冻干试剂溶解后应分装并于20 保存。2）在洗涤缓冲液1 和 2 中没有加入无水乙醇。加入乙醇后，充分混匀洗涤缓冲液W1 和 W2 ，并且作标记，表明乙醇己加入。3）试剂和样本没有充分混匀。每次样本管中加入试剂后都需要及时混匀。4）您可能没有选用适合的试剂来
5、洗脱DNA 。洗脱 DNA 需要碱性条件，使用试剂盒中提供的洗脱缓冲液进行洗脱。5）裂解可能不完全。确保裂解液从混浊变的澄清，表明蛋白质已经降解。根据组织类型不同需要的裂解时间会有差异。裂解通常需要 1-3 小时， 为保证其效率，可以使用振荡水浴的方法（如实验操作中所述）。样品中加入蛋白酶后要立即混匀。裂解液加入结合柱前将样品与异丙醇充分混匀。6 ）从组织中提取的产量低。在进行消化与裂解步骤之前确保组织破碎为小块（或粉末状），以下两步增加了与蛋白酶一起孵育的时间： A 将组织与蛋白酶孵育过夜。 B. 将组织与蛋白酶孵育 3 4 小时，然后加入新鲜的蛋白酶 30 l再孵育 1 2 小时。7）产物
6、在 260nm 处的吸光值 (A 260 )太高。结合柱中的玻璃纤维可能与核酸一同被洗脱下来。这些纤维可以将光散射，造成了较高的吸光值读数。在最后的洗脱阶段，太多的离心也可能导致将结合柱中的玻璃纤维洗脱下来，除去玻璃纤维的方法如下面所述。Q2 .提取的 DNA 不能够被酶切或酶切完全A2. 结合柱中的玻璃纤维可能同核酸一起被洗脱下来。这些纤维会抑制酶切反应。最终洗脱步骤完成后，以最大速度离心分钟，可以在管底看到玻璃纤维，把上清液转移到一个新管中，不吸出原来管中的玻璃纤维即可。Q3 组织样本中的DNA 降解A3. 获得的组织样本应立即 -20 C 冷冻保存，直至开始裂解步骤。使用研钵和研棒在液氮
7、作用下将组织研磨成粉末，在没有裂解的组织中可能有核酸酶活性。Q4 血液样本的提取最终洗脱步骤仍有颜色A4. 结合柱可能洗涤不充分，应洗涤结合柱直至流出液体成无色，将200 l洗脱液与 200 lGC 缓冲液混合，再加入 100 l 异丙醇，重复纯化步骤。Q5 在某些缓冲液中有白色沉淀(TL或 GC 缓冲液 )A5. 经过在低温下的长期存放，组织裂解缓冲液或结合缓冲液中可能出现白色沉淀。在60C 孵育可使沉淀溶解。沉淀对结果无影响，在较高温度下溶解沉淀后不会提高产量及纯化的核酸质量。AccuPrep?GMO提取试剂盒TOPQ1. DNA产量或纯度低A1. 1) 试剂盒保存条件不适当。到货后存于1
8、5-25 。2) 缓冲液或其他试剂暴露在不合适的条件下，导致了效率降低。确保试剂到货后存放于室温 (1525 C)，试剂使用后瓶盖要拧紧，保持其pH 值及稳定性，避免污染。冻干试剂溶解后应分装并于 2 8 或 -15 -25 保存。3)使用前在洗涤缓冲液中没有加入无水乙醇。加入乙醇后充分混匀并存于15 25 。做标记标明是否已加入。4)试剂和样本没有充分混匀。每次样本管中加入试剂后都需要及时混匀。Q2. DNA 洗脱回收率低A2. 可能使用了不适当的洗脱缓冲液。不要用水洗脱，请用试剂盒中提供的洗脱缓冲液洗脱。Q3. 提取的 DNA 不能够被酶切或酶切完全A3. 结合柱中的玻璃纤维可能同核酸一起
9、被洗脱下来。这些纤维会抑制酶切反应。最终洗脱步骤完成后，以最大速度离心分钟，可以在管低看到玻璃纤维，把上清液转移到一个新管中，不吸出原来管中的玻璃纤维即可。Q4. 产物在 260nm 处的吸光值 (A 260 )太高A4. 结合柱中的玻璃纤维可能与核酸一同被洗脱下来。这些纤维可以将光散射，造成了较高的吸光值读数。除去玻璃纤维的方法如上所述。Q5. DNA 产量低A5. 1) 蛋白酶 K 溶解不完全。按照下面步骤完全溶解蛋白酶K:1.吸取 2.5ml 双蒸水加入蛋白酶K 冻干粉小瓶中。2.盖上瓶盖，颠倒几次使蛋白酶K 完全溶解。3.分装并做标记，存于15 to -25C。注意 : 按照此种方法溶
10、解的蛋白酶K 至少可稳定存放12 个月。2) 裂解不完全。加入蛋白酶 K 后立即将样本混匀。裂解液加入结合柱前要与异丙醇彻底混匀。Q6. 从组织中提取产量低A6. 蛋白酶 K 消化不完全。确保消化与裂解步骤之前组织破碎成小块。有两种方法增加孵育时间：. 组织与蛋白酶 K 一起孵育过夜 , 或孵育蛋白酶K 34 小时，再加入30 L蛋白酶 K 温育 12 小时。Q7.组织样本中的 DNA 降解A7.在没有裂解的组织中存在核酸酶活性。组织在进行裂解步骤前应该冻存于-20 C，样品进行匀质化时使用小块组织 (20-40 mg) 。Q8.血液样本的提取最终洗脱步骤仍有颜色A8.结合柱可能洗涤不充分，应
11、洗涤结合柱直至流出液体成无色，将200 l洗脱液与 400 l 结合缓冲液混合，再加入 100 l 异丙醇，重复纯化步骤 。Q9.在 PL 缓冲液和B 缓冲液中有白色沉淀A9. 经过在低温下的长期存放，PL 缓冲液或 B 缓冲液中可能出现白色沉淀。在70C 孵育可使沉淀溶解。沉淀对结果无影响，在较高温度下溶解沉淀后不会提高产量及纯化的核酸质量。AccuPrep?PCR纯化试剂盒TOPQ1.低产量A1. 1. 您是否将 PCR 产物与结合缓冲液充分混匀？不足浓度的离液盐不会增加DNA 与结合柱的吸附。2.您是否在洗涤缓冲液中加入了足量的无水乙醇？浓缩的洗涤缓冲液可以洗去结合的DNA 。3.使用不
12、正确的洗脱缓冲液可能会降低产量。洗脱缓冲液不能含有太多盐离子，最适pH 值应为 7.0-8.5。Q2.样品在琼脂糖凝胶中上样后漂浮A2. 样品可能包含残留的洗涤缓冲液因而导致漂浮。必须离心确保柱子中没有挂壁的液滴。如果这种情况持续发生，第二次离心后可以将柱子在空气中晾干10 min ，然后再进行洗脱。Q3.后续酶切反应不正常A3. 1. 样品中高浓度的盐离子会抑制酶切反应，这种情况下，应在结合柱中加入洗涤缓冲液后静置5 min,再离心。2. 样品中包含残留的洗涤缓冲液， 残留的乙醇影响酶切反应的进行， 结合柱必须完全干燥。如果这种情况持续发生，第二次离心后可以将柱子在空气中晾干10 min ，然后再进行洗脱。3. 玻璃纤维与核酸一同被洗脱下来干扰了酶的活性，离心1min 将上清转移至一个新管即可。AccuPrep?质粒提取试剂盒TOPQ1.质粒产量低A1. 1.
