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1、Microbiology (2007), 153, 18421851DOI 10.1099/mic.0.2006/004390-0浑球红细菌的phrA基因编码的光聚酶以及单线态氧和过氧化物以E-依赖的方式对光聚酶的调节作用摘要：浑球红细菌是一种兼性光合作用菌，它的基因组能够编码3种光聚酶/隐花色素家族蛋白质。本文显示了phrA (RSP2143)编码的一种功能性光聚酶，这种光聚酶是一种能够修复UV辐射诱导的DNA损伤的，修复的过程具有蓝光依赖性特征。在光存在的条件下，phrA生物表达具有正向调节效应，该调节过程不包括光感受器或者光合电子转移。这个结果显示单线态氧和过氧化物依赖的信号是通过E-因
2、子来传递的，并且通过抗E-因子来影响phrA的表，而超氧负离子不会phrA的的表达。因此，E调节子不仅仅参与对单线态氧反应，也参与到对过氧化物的反应中。引言所有的有机体都暴露于太阳光下，来面对UV诱导的DNA损伤的问题。主要的光产物是环丁烷嘧啶二聚体（CPDs），含量比较低的是嘧啶-嘧啶（6-4）光产物(reviewed by Sancar, 2003)。这两种光产物的积累会导致DNA的复制和转录过程被阻断，而这将会使细胞致死。在蓝光或者近UV区 ，DNA光聚酶修复这些光产物的光化反应，就比如光复活作用(Rupert 等., 1958)。光聚酶与隐花色素的相关性非常大，它们都属于相同的蛋白质家
3、族的成员(Cashmore 等., 1999)。 隐花色素缺乏光复活作用的能力，但是我们了解到的它的抑制的一些功能，例如：在不同的有机体中的蓝光光受体会受到COP1 和时钟蛋白类的相互影响(Yang 等., 2001; Lin & Shalitin, 2003; Sancar, 2003)。光照条件会使植物的隐花色素间接影响茎的延伸以及光周期性的开花(reviewed by Lin & Shalitin, 2003)。动物体中的隐花色素是昼夜节律钟的光依赖性的以及光独立性的调节器(reviewed by Sancar, 2003)。几乎所有的真核隐花色素都含有C-末端区域，这个C-末端区域在光
4、聚酶的同源区域外，而原核生物的隐花色素缺乏这些C-末端区域的延伸(reviewed by Partch & Sancar, 2005; 图 1)。目前已经鉴定出的隐花色素有果蝇属的隐花色素、鼠耳芥隐花色素、集胞藻属隐花色素、人类(隐花色素DASH)的蛋白质缺乏C-末端的延伸。我们发现这个隐花色素的群体能够特异性的修复单联DNA的CPDs(Selby & Sancar, 2006)，并且将它的成员都认为是光聚酶。 光聚酶/隐花色素家族的蛋白质含有两个非共价结合的生色基团。首先是，还原型的FAD，他是光复活作用的催化辅因子。第二个辅因子是次甲基四氢叶酸（methenyltetrahydrofola
5、te），8-羟基-7,8-二甲基-5-去氮杂核黄素(8-HDF),黄素单核苷酸(FMN)或者黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）(reviewed by Sancar, 2003; Ueda et al., 2005; Fujihashi et al., 2007)，作为一种捕光色素（photontenna）。浑球藻属的不产氧光合变形菌的代谢作用极其多样化。浑球红细菌利用光进行不产氧光合作用，并且也可以进行有氧呼吸和无氧呼吸。对于自由生活的水生细菌，在它的天然的栖息地中，浑球红细菌暴露在太阳光(Page 等., 2004)。然而，高强度的太阳辐射是有害的，是因为会产生DNA的光产物。存在氧和红菌叶绿素
6、时，浑球红细菌会产生高活性的单线态氧，这将会导致光化学损伤的产生(Borland 等., 1987)。为了使光化学损伤的风险最小，依据环境条件的变化，红细菌具有变化的复杂的调节回路，它可以控制光合基因的表达。在高氧张力条件下，无论是有氧还是无氧环境，细菌事实上几乎是未染色的，并且进行有氧呼吸。只有当氧分压下降时，光和器官会形成(Zeilstra-Ryalls 等., 1998)。当浑球红细菌生长于缺氧条件下进行无氧呼吸，光照对光和基因的表达具有刺激效应(Braatsch 等., 2002)。目前对于保护浑球红细菌来抵抗光化学损伤的压力的调查研究发现，需要E-因子(RSP1092) 以及抗E-因
7、子ChrR(RSP1093)的参与(Anthony 等., 2005; Glaeser & Klug, 2005)。E是因子的外细胞质的功能（ECF）家族的成员。ChrR属于含锌的抗E-因子一种新的家族(Newman 等., 2001)，并且会抑制E的能力，来形成稳定的复合体，该复合体具有RNA多聚酶的中心，通过形成E：ChrR复合体(Anthony 等., 2004)。图 1 光聚酶/隐花色素家族的蛋白质的序列比对。相同的氨基酸用灰色的框标记出来了。从聚球藻 sp.6301(Tamada 等., 1997; top line)和集胞藻sp. PCC 6803(Brudler等., 2003;
8、 bottom line)的晶体结构中获得结合有辅因子FAD (F) 和 8-HDF (H)的氨基酸。括号内显示了蛋白质的长度。Sco. Phr,是聚球藻 sp. 6301的光聚酶(Tamada 等., 1997)；R.s. PhrA,是浑球红细菌的光聚酶；R.s. 1981,是浑球红细菌RSP1981基因的光产物；R.s. 3077,是浑球红细菌RSP3077基因的光产物；Scy. Cry,是集胞藻 sp.PCC6803的隐花色素DASH(Brudler 等., 2003)。用MultAlin软件进行对比(http:/prodes.toulouse.inra.fr/multalin/mult
9、alin.html)。浑球红细菌的基因组能够编码3种蛋白，RSP1981, RSP2143和RSP3077产物，与光聚酶和隐花色素非常相似。在此，我们显示了RSP2143，我们推断它为phrA(Braatsch 等., 2004)，编码一种功能性的光聚酶。RSP3077也充当着光聚酶的功能，而RSP1981对光复活反应没有功能。此外，在不同的生长条件下，phrA的表达的的分析显示光复活作用会受到E/ ChrR系统的调节。方法菌株和生长条件 本研究中使用的所有菌株都在表1中列出来了。大肠杆菌（Escherichia coli）的菌株用LuriaBertani（LB）培养基培养，温度为37，转速为
10、180 r.p.m连续振荡培养。浑球红细菌的培养条件为：盐度最小的苹果酸培养基(Drews, 1983)，温度为32，140 r.p.m连续的振荡培养。 在整个实验过程中，对于半需氧的浑球红细菌的生长，培养瓶中氧气的浓度是10424 mM。用Pt/Ag electrode (microoxygen sensor 501, UMS, Meiningen, Germany)来监测氧分压，氧分压的调节通过改变振荡培养的速度。在进行光照之前，将过夜生长的细胞置于这些不同的转速的条件下生长双倍的时间，并且当培养物的OD660值达到0.2时开始进行实验。半需氧生长通过从500W的卤素灯中获得蓝光或者从高压
11、水银等中获得蓝光(Schoeffel Instruments Co.)，卤素灯和高压水银的光需要先通过具有热吸收能力的过滤器KG1和过滤器BG12 联合器(Schott)。这种过滤器的最大透光的波长是400nm，它的半环的宽度80nm，并且在317nm或者515nm处没有可探测的光传递。在培养水平上对每一种光量的光子通量密度的检测分别是10 mol 光子 m -2 s -1 (3 W m -2 )或者是至少60 mmol 光子m -2 s -1 (60 W m -2 )。 表 1 本研究中使用的菌株和质粒*Kmr , 卡那霉素抗性; Smr , 链霉素抗性; Spr , 大观霉素抗性; Tcr
12、 , 四环素抗性; Tpr , 三甲氧苄二氨嘧啶抗性.对于有氧生长，当过夜培养的培养液的OD660达到0.2时，将培养物转接到培养瓶中，并且通入空气，使培养瓶中的氧气浓度大约能达到180 mM。为了检测光照对生长的影响，在黑暗条件下生长的培养物，当OD660达到0.4时，用500W的卤素灯照射培养物，光照的强度为800 W m -2 (750 mol光子m-2 s-1 ;高强度的白光)，或者800 W m -2 (380mol光子m-2 s-1 ;高强度的红光)，或者30 W m -2 (18 mol光子m-2 s-1 ;低强度的白光)。过滤器的发射波长大于600nm，被用于红光照射。用LI-
13、250光公尺来检测W m -2的光能，LI-250光公尺带有LI-200SA辐射传感器(光谱响应的波段为4001100 nm, LI-Cor)；并且用LI-189光公尺来检测mol光子m-2 s-1的光子通量，LI-189光公尺带有一个LI-190SA的量传感器(光谱响应的波段为400700 nm, LI-Cor)。 根据实验的需要，抗生素使用的浓度如下，卡那霉素：25g ml-1；四环素：20g ml-1（E. coli）或者2g ml-1（R. sphaeroides）；三甲氧苄二氨嘧啶：50g ml-1（R. sphaeroides）。在有光条件下，不添加四环素。为了产生单线态氧，向培养
14、基中加入甲基蓝(Sigma-Aldrich)，终浓度为：0.2 mM。为了检测过氧化氢（H2O2）以及超氧负离子对phrA表达的影响，当OD660达到0.5时，向浑球红细菌的培养基中加入H2O2和百草枯（除草剂），使其终浓度为1 mM。光复活作用的活力当红细菌的过夜培养物生长到OD 660达到0.8时，用盐度最小的苹果酸培养基按1 : 100的比例进行稀释。在254nm下经过不同剂量的UV光照射(UVcross-linker 1800, Stratagene)，将细胞涂布在琼脂平板上，置于暗室中培养（有微弱的红光），之后再将其置于58 W的荧光灯(TLD 58W/25, Philips)下培养。进行光复活反应，用塑料培养皿覆盖在平板上。培养基水平上检测光子通量密度是3540 mol光子m-2 s-1(LI-190SA quantum Sensor, LI-Cor; spectral response 400700 nm)。对照组的平板用铝箔包好，置于黑暗环境下进行生长培养。经过3天的培养之后，进行菌落计数，并且计算了与未经UV照射的对照组相比
