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1、低温海水硝彳化细菌富集培养过程及影响因素硝化细菌为化能自养，生长缓慢，对环境因素变化敏感1-2。其 中温度对硝化细菌的活性影响较为明显，多数硝化细菌的适宜温度为 28 C。左右，当温度低于15 C。时硝化作用急剧下降甚至停止。在冬季 海水养殖中，多数硝化细菌无法耐受其低温环境，活性被极大抑制， 对养殖状况不利。自然界中耐低温的硝化细菌数量和种类较少，因此 低温海水环境中硝化细菌的驯化和富集培养显得尤为重要。目前，对于硝化细菌的富集培养、分离纯化与筛选方面的特性研 究与应用较为广泛5-6，其中也不乏对低温环境硝化细菌富集、筛选 与多样性方面的研究7-9，然而目前大多是针对淡水低温环境硝化细 菌的
2、富集培养，对海水低温条件下的应用实践（如工厂化冷水鱼养殖 系统）可能效果甚微。因此，本研究构建一种低温海水型硝化细菌富 集培养方法，研究了低温海水环境中不同条件对硝化细菌活性的影响， 确定其适宜的生长环境，同时探究了无机氮盐去除率与底物浓度的关 系，为低温海水硝化细菌富集培养条件的优化提供理论依据。1材料与方法1.1试验材料试验用海沙取自冬季青岛某海水浴场35 cm浅层海沙；氨氧 化细菌（AOB）培养液由氯化铵（AR）、碳酸氢钠（AR）、人工海水配 制而成；亚硝酸盐氧化细菌（NOB）培养液由亚硝酸钠（AR）、碳酸 氢钠（AR）、人工海水配制而成。1.2 试验方法1.2.1富集培养方法培养装置见
3、图1。海沙经适当处理后分别加 入2个烧杯，烧杯有效体积为5 L，两烧杯内加入海沙体积各1 L。分 别向烧杯中加入事先配好的人工海水各4 L，盐度为30%。将烧杯置 于水箱，水缸液面略低于烧杯液面，烧杯中配备搅拌和曝气装置。使 用冷水循环机将水温控制在1114 C。，使用搅拌器进行充分混合， 控制溶解氧含量在4.04.5 mg/L。定期加入碳酸氢钠溶液以调节pH。 初期分别向AOB和NOB烧杯中加入氯化铵和亚硝酸钠，使培养基中 氨氮和亚硝酸盐氮浓度达到10 mg/L。每隔24 h检测烧杯中氨氮和 亚硝酸盐氮浓度，当浓度达到较低水平时分别补充至10 mg/L,当硝 化速率提高时，分别将培养基中氨氮
4、和亚硝氮浓度提高至30 mg/L和 100 mg/L。培养过程中每隔24 h测定氨氮和亚硝酸盐氮浓度。图1培养装置示意图1.2.2影响因素研究方法 试验通过控制温度、DO等相同条件， 选取pH与底物浓度作为环境变量以探究培养所得低温AOB和NOB 菌种的适宜生长环境。1.2.3水质监测方法 氨氮和亚硝酸盐氮分别采用纳氏试剂分光 光度法和N- （1-萘基）乙二胺光度法测定；溶解氧使用哈希溶解氧 仪（HACH-HQ30d）测定;pH使用哈希便携式pH计（HACH-HQ30d） 测定。2过程与步骤2.1.1菌种富集与筛选分离菌种富集过程在1.2.1的基础上进行， 当富集培养物硝化强度达到一定水平不再
5、升高时，将AOB和NOB培 养基静置2 h后分别加入一定量硅藻土材料（主要成分为SiO2,孔隙 度大、吸收性强、化学性质稳定、成本低廉）便于硝化细菌吸附。为 筛选和纯化所得菌种，加入硅藻土一段时间后需再次将培养基静置沉 淀并分离出海沙，然后再次向AOB和NOB培养基中各添加一定量硅 藻土。2.2.2 pH对硝化强度的影响 各取等量4份AOB和NOB培养液 200 mL于8个500 mL摇瓶中（摇瓶经高温灭菌处理），在15 C。、溶 解氧455 mg/L、避光条件下，分别投加氯化铵和亚硝酸钠使氨氮 和亚硝酸盐氮底物浓度为20 mg/L和40 mg/L，调节pH分别为6.5、 7、7.5、8，每隔
6、6 h检测氨氮和亚硝酸盐氮浓度，测定不同pH条件 下氨氧化速率和亚硝酸盐氧化速率。2.2.3底物浓度对降解效率的影响 各取等量4份AOB和NOB培 养液200 mL于8个500 mL摇瓶中(摇瓶经高温灭菌处理),在15 C。、 溶解氧4.55 mg/L、pH值77.5、避光条件下，分别投加氯化铵使 初始氨氮浓度分别为10、20、30、40 mg/L,分别投加亚硝酸钠使亚 硝酸盐氮初始浓度分别为40、80、120、160 mg/L,每隔6 h检测氨 氮和亚硝酸盐氮浓度，确定不同底物浓度条件下氨氧化速率和亚硝酸 盐氧化速率。3结果与分析3.1硝化细菌富集培养过程AOB和NOB富集培养过程中硝化强度
7、变化见图2、图3,可以 看出，初期海沙中AOB和NOB硝化强度极低，富集培养10 d后， AOB 硝化强度为 1.5 mg (NH3-N) / (Ld)，NOB 为 0.5 mg (NO-2- N)/(Ld)，随后1030 d，由于只添加无机氮盐，培养基中有机物 含量较低使得异养菌数量减少，与此同时，以无机氮盐为主要营养来 源的化能自养型AOB和NOB得以迅速繁殖，硝化强度得以提高，富 集培养 30 d 时 AOB 为 4 mg (NH3-N) / (Ld)，NOB 为 4.5 mg (NO- 2-N)/(Ld)。富集培养3060 d时，由于海沙晶粒表面光滑少孔， 对AOB和NOB的吸附能力有
8、限，硝化细菌没有足够的附着场所进行 生长繁殖和正常的生理活动，使得硝化强度在该段时间内趋于平缓。 分别向AOB和NOB培养容器内各添加200 g硅藻土，由于硅藻土疏 松多孔、比表面积大的特质使得游离的硝化细菌得以附着，硝化强度 在6090 d这段时间内有了明显升高，硝化强度AOB由5 mg(NH3- N) / (Ld)升高至 13 mg (NH3-N) / (Ld)，NOB 由 12 mg (NO- 2-N) / (Ld)升高至39 mg (NO-2-N) / (Ld)。为分离纯化培养的 硝化细菌，停止搅拌和曝气，将培养基静置一段时间后取走最初放入 的海沙，此时，由于带走一部分海沙上附着的硝化
9、细菌使得原先的硝 化强度有了一定程度的减弱。AOB硝化强度在培养120 d时降至9 mg (NH3-N) / (Ld)，NOB 在培养 110 d 时降至 29 mg (NO-2-N) /(Ld)。随后再次向培养容器中分别添加硅藻土 200 g，硝化强度随 之增强，AOB 为 21 mg (NH3-N) / (Ld)，NOB 为 93 mg (NO-2-N） / （Ld）。经过150 d低温驯化后AOB平均硝化强度由1.5 mg （NH3-N） / （Ld）提升至 21 mg （NH3-N） / （Ld）,为培养初期的 14倍，NOB平均硝化强度由0.5 mg（NO-2-N）/ （Ld）提升至
10、93 mg（NO-2-N）/（Ld），为培养初期的186倍。图2 AOB富集培养过程中硝化强度变化图3 NOB富集培养过程中硝化强度变化3.2 pH对细菌硝化强度的影响3.2.1 pH对AOB硝化强度的影响pH对AOB的氨氮降解效果影 响见图4。由图可以看出，对于AOB在pH为7.5到8.0范围内氨氮 降解速率高于pH在6.5到7.0之间，且当pH为8.0时氨氧化活性最 高，为 0.677 mg（NH3-N）/（Lh）。分别为 pH 在 6.5、7、7.5 时的 1.22、119和1.03倍。分析原因可能是水溶液中NH3-N与NH+4-N 存在电离平衡，NH3-N是氨氧化细菌的真正硝化基质，升
11、高一定的 pH可增加溶液中NH3-N占比从而提高基质有效性，促进氨氧化反 应的进行。图4 pH对AOB硝化强度的影响3.2.2 pH对NOB硝化强度的影响pH对NOB的亚硝氮降解效果 影响见图5。由图可以看出，对于NOB在pH为6.5到7.0范围内亚 硝氮降解速率高于pH在7.5到8.0之间，且当pH为7.0时亚硝酸盐 氧化活性最高，为1.33 mg（NO-2-N）/（Lh）。分别为pH在6.5、 7.5、80时的1.04、1.07和1.24倍。分析原因可能是水溶液中HNO2- N与NO-2-N存在电离平衡，HNO2-N是亚硝酸盐氧化细菌的真正 硝化基质，降低一定的pH可增加溶液中HNO2-N
12、占比从而提高基 质有效性，促进亚硝酸盐氧化反应的进行。图5 pH对NOB硝化强度的影响3.3底物浓度对降解效果的影响3.3.1底物浓度对AOB氨氮去除效果的影响试验结果见表1。 由表可知，AOB富集培养物对于低浓度氨氮废水（10 mg/L和20 mg/L） 去除效果较好，处理36 h后氨氮去除率达90%以上，而对较高浓度氨 氮废水（30 mg/L和40 mg/L）去除效果较差。AOB对氨氮转化速率 随底物浓度先升后降，在30 mg/L时速率达到峰值，为0.93 mg（NH3- N）/（Lh）,是其余底物浓度转化速率的2.16、1.35和1.98倍。转化 速率达到峰值后若底物浓度继续增加，速率下
13、降程度明显，导致去除 效果减弱。分析原因为，底物浓度过高产生的抑制作用和溶解氧条件 的限制都会对AOB的生理活性造成负面影响，导致氨氮转化速率下 降，降解效果减弱。3.3.2底物浓度对NOB亚硝氮去除效果的影响试验结果见表2。 由表可知，NOB富集培养物对于低浓度氨氮废水（40 mg/L和80 mg/L） 去除效果较好，处理24 h后亚硝氮去除率达90%以上，而对较高浓度 氨氮废水（80 mg/L和120 mg/L）去除效果较差。NOB对亚硝氮转 化速率随底物浓度先升后降，在80 mg/L时速率达到峰值，为5.5 mg （NO-2-N）/（Lh），是其余底物浓度转化速率的1.51、1.86和2
14、.78 倍。转化速率达到峰值后若底物浓度继续增加，速率下降程度明显， 导致去除效果减弱。分析原因与氨氮同理，底物浓度过高产生的抑制 作用和溶解氧条件的限制都会对nob的生理活性造成负面影响，导 致氨氮转化速率下降，降解效果减弱，且底物抑制对转化速率影响程 度更大。3.3.3无机氮浓度对硝化强度的影响在底物浓度试验中，发现氨 氮和亚硝氮浓度对AOB和NOB的硝化强度具有一定影响，结果见图 6、图7。由图可知，随着无机氮盐浓度增大，AOB和NOB对氨氮和 亚硝氮的降解速率均呈现先增大后减小的规律。分析原因，一方面当 无机氮盐浓度较低时，由于缺乏营养和能量来源，AOB和NOB的生 长和活性受到抑制，
15、导致硝化强度较弱；另一方面，随着无机氮盐浓 度的升高，AOB和NOB获得足够的营养来源，硝化强度随之增强。 但当氨氮浓度超过30 mg/L、亚硝氮浓度超过80 mg/L时，由于底物 对AOB和NOB活性的抑制使得硝化作用减弱，硝化强度随之降低。 由此可得，当氨氮和亚硝氮浓度分别达到30 mg/L和80 mg/L时可 使AOB和NOB硝化强度达到较高水平，为完善富集培养条件和获得 更高效的硝化细菌提供了理论依据。图6不同氨氮浓度下AOB硝化强度变化规律图7不同亚硝氮浓度下NOB硝化强度变化规律4结论经过长时间低温驯化，AOB平均硝化强度由1.5 mg（NH3-N） /（Ld）提升至21 mg（N
16、H3-N）/（Ld），NOB平均硝化强度由0.5 mg（NO-2-N）/（Ld）提升至 93 mg（NO-2-N）/（Ld），硝化细 菌在低温环境中具有较高活性，添加人工载体（如硅藻土）可增加硝 化细菌附着面积，提高了对氨氮和亚硝酸盐氮的转化效率。通过控制温度、溶解氧以及光照条件等培养因素发现，AOB在 pH为8.0、氨氮初始浓度为30 mg/L时硝化强度最高；NOB在pH 为7.0、亚硝氮浓度为80 mg/L时硝化强度最高。5讨论硝化作用是在一系列酶促反应下进行的，低温不仅影响细菌细胞 膜流动性并且降低菌体内氧化酶活性，从而影响作用效果。本研究控 制恒定低温环境，根据不同培养阶段硝化菌作用强度的变化相应增加 无机氮盐浓度以此提高菌群活性，对硝化强度变化进行分析，结合条 件因素对其生理活性的影响，表明培养所得AOB和NOB在1114 C。 低温环境下仍具有较高生理活性，较之前相关研究在1518
