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1、姜黄素调节SREBP和FAS改善非酒精性脂肪性肝病的研究摘要：目的：探究姜黄素对非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的作用和可能机制。方法：18只SD大鼠随机分为对照组、模型组和姜黄素组，每组各6只。模型组和姜黄素组予以高脂高胆固醇食物摘要：目的：探究姜黄素对非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的作用和可能机制。方法：18只SD大鼠随机分为对照组、模型组和姜黄素组，每组各6只。模型组和姜黄素组予以高脂高胆固醇食物10ml/kg灌胃，对照组给予等量生理盐水灌胃。建模成功后，姜黄素组每日给予姜黄素100mg/kg灌胃，对照组和模型组给予等量的羧甲基纤维素钠。治疗4周后，检测大鼠血清ALT、AST、甘油三酯
2、(TG)和总胆固醇(TC)水平，HE染色观察大鼠肝脏组织病理学变化，免疫组织化学法检测大鼠肝组织固醇调节元件结合蛋白(SREBP)和脂肪酸合成酶(FAS)蛋白的表达情况，蛋白免疫印迹法检测沉默调节蛋白6(Sirt6)和磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)蛋白表达变化。结果：模型组ALT、AST、TG、TC、SREBP和FAS蛋白表达均高于对照组(P均本文源自新医学,2022,51(11):871-876.?新医学?杂志创刊于1969年，是中华人民共和国教育部主管，中山大学主办，中山大学附属第三医院承办的综合性医药卫生类月刊。2022年获“广东省第四届期刊提名奖，2022年继续入选为中国科技
3、论文统计源期刊(中国科技核心期刊)。非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指排除长期大量饮酒和其他明确的肝脏损伤因素所引起的脂质在肝细胞中储积为病理改变的肝脏代谢性疾病。近年来，NAFLD逐渐成为全球最常见的慢性肝病1。目前关于NAFLD发病机制尚不十清楚确，现被公认的是“二次打击学说。其可能的机制有氧化应激、内质网应激、胰岛素抵抗、炎症反响以及自噬与DNA损伤等2,3,4。固醇调节元件结合蛋白(SREBP)和碳水化合物反响原件结合蛋白是调节肝脏脂质合成的关键性基因，进而参与调控肝脏脂质代谢过程5,6。因此，通过寻找有效药物抑制SREBP表达，对于改善NAFLD脂质代谢紊乱至关重要。姜黄素是一种多
4、酚类物质，从植物姜黄中提取。研究发现，姜黄素具备抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗自噬、抗胰岛素抵抗等作用，且对于糖尿病、COPD、动脉粥样硬化、自身免疫性疾病的治疗都有确切的效果。既往研究发现，姜黄素能够通过调节SREBP，进而参与肝脏脂质代谢7。在NAFLD大鼠中，降脂颗粒可以通过下调肝X受体和SREBP-1c的表达，调节脂肪酸代谢8。但是有关姜黄素对SREBP调节的分子机制尚不完全清楚。因此，本实验研究通过构建NAFLD型大鼠模型，探究姜黄素对SREBP的分子调控机制。材料与方法一、材料1.实验动物实验选取雄性SPF级别，体质量为180200g的SD大鼠共18只(购于锦州医科大学动物中心)并通过动
5、物伦理委员会批准(批号：20220816)，实验动物饲养于湿度在30%70%、温度维持在25的动物房内并采取昼夜交替光照处理。2.主要实验药品及试剂胆固醇(万邦实业，批号：2022031625)，姜黄素(上海瑞永生物科技)，SREBP一抗和脂肪酸合成酶(FAS)一抗抗体(武汉Proteintech)，沉默调节蛋白6(Sirt6)一抗(武汉博士德公司)，腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)一抗(美国CellSignalingTechnology)，-actin一抗(江苏碧云天公司)PVDF膜(Millipore公司)，SDS-PAGE凝胶(武汉博士德公司)，一抗、二抗稀释液(江苏碧云天公司)。3.主要
6、实验仪器纯水仪器(湖南湘仪公司)，酶标仪(江苏碧云天公司)，组织切片机(武汉赛默飞公司)，荧光倒置显微镜(日本Olmpus公司)，凝胶电泳装置(北京六一生物科技)，显影仪(上海西唐生物科技)，脱色摇床(上海鲁硕实业)，高速离心机(上海卢湘仪离心机仪器)。二、方法1.造模及分组将18只实验大鼠随机分为3组，每组各6只，即为对照组、模型组、姜黄素组。模型组和姜黄素组予以高脂高胆固醇食物10ml/kg灌胃，对照组给予生理盐水10ml/kg灌胃。其中高脂高胆固醇食物的配制为60%猪油、10%胆固醇及30%玉米面加200ml食用水，熬制成糊状，放入37恒温箱内，对照组给予常规饲料饲养。3个月后随机处死模
7、型组和姜黄素组各1只大鼠，肝脏病理见肝脂肪细胞变性说明建模成功。姜黄素组给予姜黄素100mg/kg按每日1次给药;对照组和模型组给予等量的生理盐水灌胃;持续给药4周。隔夜禁食水，次日清晨予大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉，称重、解剖并左心室采血，取局部肝脏组织浸泡于4%的多聚甲醛，经脱水、石蜡包埋后行HE染色和免疫组织化学检测。2.相关指标检测按照试剂盒说明书进行大鼠血清中ALT、AST、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)含量测定。HE染色：4%的多聚甲醛固定大鼠肝脏组织，石蜡包埋后切片，之后行HE染色操作。免疫组织化学染色：(1)石蜡切片60下烘烤1h;(2)脱蜡至水，二甲苯处理3次，每次5m
8、in，无水乙醇处理3次，每次10min,95%乙醇处理2次，每次10min,ddH2O洗2次，每次5min,0.01mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，每次10min;(3)消除过氧化物酶体，3%H2O2溶液孵育10min,0.01mmol/LPBS洗3次，每次5min;(4)微波抗原修复，枸橼酸钠缓冲液(pH6.0)250ml置于微波炉中450W预热5min，将组织放入缓冲液中，微波250W加热10min，冷却至室温，约耗时40min，双蒸水洗3次，每次5min,PBS洗3次，每次5min;(5)封闭，利用5%的BSA封闭1h;(6)打孔透膜，利用0.3%的TritonX-100孵育1
9、0min;(7)一抗孵育，4湿盒孵育SREBP和FAS抗体过夜;(8)二抗孵育;(9)二氨基联苯胺(DAB)显色、苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明;(10)中性树胶封片和显微镜下观察结果。蛋白免疫印迹法：(1)组织碾磨，将处理完成的各组大鼠肝脏组织取出，采用PBS清洗后并用手术剪刀剪取少许肝脏组织放置于组织碾磨管内，按照15的比例参加组织裂解液后放置于组织碾磨仪中充分碾磨35min;(2)离心，4以12000rpm离心15min，取组织上清液;(3)蛋白质浓度测定，利用二辛可宁酸(BCA)法进行蛋白质浓度定量测定;(4)凝胶电泳，按照上样量为40g进行蛋白凝胶电泳120min;(5)转膜，
10、依据蛋白质marker指示进行切胶，并放置聚偏二氟乙烯(PVDF)膜进行转膜约90min;(6)封闭，5%的脱脂牛奶封闭12h;(7)孵育一抗，洗脱完成，孵育对应的一抗过夜;(8)孵育二抗，室温条件下，二抗孵育约2h;(9)显影，将孵育完成的PVDF膜使用吐温-20的PBS洗涤23次，每次5min，滴加显影液显影并拍照。三、统计学处理采用SPSS18.0进行数据分析。正态分布计量资料采用表示，多组间比拟采用单因素方差分析，两两比拟采用LSD-t检验。P结果一、姜黄素对大鼠血清生化指标的影响与对照组相比，模型组ALT、AST、TG和TC增高，差异均有统计学意义(P均二、HE染色观察大鼠肝脏组织形
11、态学变化与对照组相比，模型组肝小叶内弥漫性分布着空泡细胞，空泡大小不一，肝小叶结构尚存，边界模糊，有淋巴细胞分布于肝脏。相比于模型组，姜黄素组的肝小叶内空泡细胞明显减少，肝小叶结构清晰，肝脏内的空泡细胞数量最少，见图1。表1各组血清生化比拟图13组肝脏组织形态学变化(HE染色，200)三、免疫组织化学法检测大鼠肝脏组织中的SREBP和FAS表达SREBP和FAS的定位都位于细胞质内：与对照组相比，模型组SREBP和FAS的表达增加;与模型组相比，姜黄素组SREBP和FAS的表达减少，见图2。四、姜黄素对大鼠肝脏Sirt6和p-AMPK表达的影响3组肝脏组织Sirt6和p-AMPK蛋白表达比拟差
12、异均有统计学意义(FSirt6=12.83,PSirt6=0.001;Fp-AMPK=16.67,Pp-AMPK讨论NAFLD是以弥漫性肝细胞脂肪病变而导致的一种病理性临床病理综合征。NAFLD是一种进展性疾病，其发病机制尚不明确。既往研究发现胰岛素抵抗、脂质代谢异常、炎性细胞因子和氧化应激所致肝细胞凋亡等因素是NAFLD发生和开展的主要原因9。现有研究者提出在NAFLD的“二次打击学说中，初次主要是胰岛素抵抗所致，胰岛素抵抗主要通过促使外周脂解增加和高胰岛素血症引起肝细胞脂肪蓄积，并增加了对内、外源性损害因子敏感性。二次打击主要为反响性氧化代谢产物、脂肪细胞因子、肠应激和肠道菌群内毒素等各种
13、损害因子诱导活动UCP-2、FAS配体等，进而使得脂肪变性的肝细胞出现炎症、坏死等一系列病理生理学改变10,11,12。图肝脏和-蛋白表达图肝脏和的表达(免疫组织化学染色)NAFLD是指中性脂肪在肝细胞内以脂滴或者脂质囊泡的形式在胞质中过度积累。在诸多研究中发现总胆固醇在NAFLD是非酒精性脂肪性肝炎形成和开展中所起的脂毒性作用尚不完全清楚。因此，通过研究NAFLD中胆固醇合成和代谢的相关基因显得尤为重要。SREBP属于螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链(bHLH-ZIP)结构家族，是一种节脂质合成的转录因子家族，是由SREBP1a、SREBP1c、SREBP2三种亚型构成13,14。多项研究均指出S
14、REBPS在NAFLD的发生开展中起重要作用。近年来诸多研究也发现姜黄素可以通过降低TG、TC改善NAFLD。研究发现，姜黄素可通过下调节SREBP和FAS表达，减少脂质在肝脏内沉积，降低脂毒性对肝脏损害，进而保护肝脏细胞，使得病情得以逆转，从而治疗NAFLD15。对此本研究初步研究发现，相比于模型组，通过姜黄素大鼠灌胃处理的NAFLD组SREBP和FAS的表达明显下降，AST、ALT、TG和TC水平均明显降低。上述结果说明，姜黄素可能通过调节SREBP和FAS，从而降低TG、TC等合成，改善NAFLD。那么姜黄素是通过何种分子机制调控SREBP表达?Sirt6是Sirtuins家族成员之一，
15、具有高度保守的NAD+依赖性的去乙酰化酶，可能通过调节内皮一氧化氮合酶而发挥抗心肌肥大的作用16。以往研究发现，Sirt6基因缺失是导致TG累积的主要因素，与脂肪性肝脏疾病密切相关17。在高脂喂养的小鼠中Sirt6的表达显著降低，通过过表达Sirt6可以降低小鼠血液脂质含量，减少肝脏内脂肪的积累18。亦有研究证实，Sirt6可以通过增加AMP/ATP比例，活化AMPK信号通路，进而调控SREBP蛋白表达19。因此，在本实验研究中，我们通过蛋白免疫印迹法检测大鼠肝脏组织中Sirt6和p-AMPK蛋白表达。结果发现，相比于对照组，模型组Sirt6和p-AMPK蛋白表达均明显降低，给予姜黄素处理可以促进Sirt6和p-AMPK蛋白表达，进而改善NAFLD。综上所述，姜黄素可以减轻大鼠NALFD的脂肪沉积和肝损伤，可能与Sirt6、p-AMPK的表达上调相关。以上研究结果为姜黄素治疗NAFLD提供了新的理论依据。参考文献：
