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1、肾综合症出血热标本的采集和检测一、病例和健康人群标本的采集、保存和运输 1. 标本采集：病例标本需采集急性期和恢复期血液标本各5ml以上，健康人群采集血液标本5ml以上；尿液标本需要采集急性发病期第一天或第二天的晨尿，尿液需采集30ml； 2. 标本分装：将采集的血清标本一式两管进行分装；尿液标本用密封管保存； 3. 标本的保存：标本放-20以下冰箱保存；4. 标本运输：用标本运输箱4条件下运输。二、鼠标本的采集、保存和运输 1. 采集标本前要做好个人防护，避免被老鼠咬伤； 2. 在采集老鼠标本前，每个载物台事先用塑料薄膜铺垫，保证每宰杀一只老鼠就要更换一次塑料薄膜，避免载物台污染； 3. 将
2、老鼠固定在载物台上，腹部朝上，用剪刀剪开老鼠腹腔和胸腔，并用止血钳拉开老鼠胸腹腔； 4. 采集老鼠血液标本时切忌直接剪开股动脉放血，以免动脉血喷射造成污染和生物安全隐患，应用注射器刺破血管或心脏抽取； 5. 采集老鼠肺脏及其它标本时应更换经过灭菌的剪刀和镊子，至少保证每个老鼠独自使用一把剪刀和镊子，用过的剪刀和镊子不要在现场重复使用； 6. 所有标本均一式两份，一份自己检测用，另一份送省疾病预防控制中心复核用； 7. 现场采集标本时要带冰排，采集的标本要及时放入标本采样箱中4保存； 8. 老鼠采集完毕后要进行深埋或焚烧处理； 9. 血清采集后和老鼠标本一同放-80保存。10. 用标本运输箱4条
3、件下运输。三、尿液标本前处理 1. 尿液标本仅适用于核酸检测； 2. 将30ml尿液用107000rmp离心2h，倒掉上清取沉淀物进行RNA提取（按照RNA提取试剂盒程序操作）。四、标本的检测 1. 病例和健康人群血清抗体检测 免疫荧光（欧蒙） lgM捕捉法（德国IBL）2. 核酸检测 Real-time RT-PCR (北京硕士) RT-PCR检测 RT-PCR检测选用QIAGEN OneStep RT-PCR Kit进行检测。 反应体系：5 OneStep RT-PCR Buffer 5l dNTP Mix 1l Enzyme 1l RNA 5l HV-SFO (10M) 1l HV-SR
4、O (10M) 1l H2O 11l Total 25l 反应条件： 50 30 Min 94 15 Min 94 1 Min 50 1 Min 35 cycles 72 3 Min 72 10 Min 巢式PCR检测巢式PCR 试剂选用 QIAGEN HotStarTaq Master Mix Kit. 反应体系： HotStarTaq Master Mix 12.5l PCR Products 2l SEO-SF/ HSF (10M) 1l SEO-SR/ HSR (10M) 1l H2O 8.5l Total 25l 反应条件： 94 15 Min 94 30 Sec 50 30 Sec 30cycles 72 40 Sec 72 10 Min3. 用于出血热检测和分子分型的引物病原体名称引物名称序列Hantavirus(S)HV-SFOGGCCAGACAGCAGATTGGHV-SROAGCTCAGGATCCATGTCATCHantaan(S)HSFAACAAGAGGAAGGCAAACAACHSRGCCCCAAGCTCAGCAATACCSeoul(S)SEO-SFTGCCAAACGCCCAATCCASSEO-SRGCCATCCCTCCGACAAACAA
