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1、生化制药大实验葛根素的提取、分离和精制一、实验目的1. 建立对生化物质提取、分离及精制过程的认识2. 了解溶剂萃取法、吸附分离法、柱层析法及结晶的基本原理3. 掌握大孔吸附树脂的分离原理和基本操作4. 掌握葛根素的提取、分离和精制方法二、实验原理葛根（Radix Puerariae）为豆科植物野葛Pueraria lobata （Willd）ohwi的根，是常用的中药，具有解肌退热、生津、透疹、升阳止泻等功效。图1 葛根葛根中含多种黄酮类成分，主要活性成分为大豆素(daidzein）、大豆甙（daidzin）、葛根素（puerarin）、葛根素-7-木糖甙（puerarin-7-xylosid
2、e）等。其主要成分为葛根素，即8-D-葡萄吡喃糖-4,7-二羟基异黄酮。葛根素具有扩张冠脉和脑血管、降低心肌耗氧量、改善心肌收缩功能、促进血液循环等作用。适用于冠心病、心绞痛、心肌梗死、视网膜动脉静脉阻塞、突发性耳聋等疾病的治疗，效果显著。1. 萃取萃取（extraction）是利用溶质在互不相溶的两项之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的方法。萃取是是工业生产中常用的分离、提取的方法之一。如果含有目标产物的原料为固体，则称此操作为液固萃取或浸取；如果含有目标产物的原料为液体，则称此操作为液液萃取。（1）液固萃取液固萃取通称浸取（leaching），是用液体提取固体原料中的有用成分的扩散分
3、离操作。生物分离过程中经常需要利用液固萃取法从细胞或生物体中提取目标产物或除去有害成分。例如，从咖啡豆中脱咖啡因，从草莓中提取花色苷色素，从植物组织中提取生物碱、黄酮类皂苷等。为了使固体原料中的溶质能够很快的接触溶剂，需对原料进行预处理，一般包括粉碎、研磨、切片等。固液萃取操作主要包括不溶性固体中所含的溶质在溶剂中溶解的过程和分离残渣和浸取液的过程。（2）液液萃取用溶剂从溶液中抽提物质叫液液萃取，也叫溶剂萃取。根据所用萃取剂性质不同或萃取机制的不同，液液萃取可分为多种类型。经典的液液萃取指的有机溶剂萃取，在生物产物中用于生物小分子的分离纯化。即在液体混合物（原料液）中加入一种与其基本不相混溶的
4、液体作为溶剂，构成第二相，利用原料液中各组分在两个液相中的溶解度不同而使原料液混合物得以分离。选用的溶剂称为萃取剂，以S表示；原料液中容易溶于S的组分，称为溶质，以A表示；难溶于S的组分称为原溶剂（或稀释剂），以B表示。液液萃取操作的基本过程：将一定量萃取剂加入原料液中，然后加以搅拌使原料液与萃取剂充分混合，溶质通过相界面由原料液向萃取剂中扩散。搅拌停止后，两液相因密度不同而分层：一层以溶剂S为主，并溶有较多的溶质，称为萃取相，以E表示；另一层以原溶剂（稀释剂）B为主，且含有未被萃取完的溶质，称为萃余相，以R表示。实现组分分离的萃取过程即由混合、分层、萃取相分离、萃余相分离等一系列步骤共同完成
5、。2. 吸附分离法吸附（adsorption）法是指利用吸附作用，将样品中的生物活性物质或杂质吸附于适当的吸附剂上，利用吸附剂对活性物质和杂质间吸附能力的差异，使目的物和其他物质分离，达到浓缩和提纯目的的方法。在工业生产中常用的吸附剂有活性炭、白陶土、氧化铝、硅胶、大孔吸附树脂等。3. 柱层析法图2 柱层析示意图柱色谱是常用色谱分析法的一种，它是将固定相装于色谱柱内，色谱过程在色谱柱内进行，按其粗细可分为一般柱色谱法、毛细色谱法及微填充柱色谱法，气相色谱与高效液相色谱都属于柱色谱范围。其装置如图2所示，色谱柱内装有固体吸附剂（固定相），液体样品从柱顶加入，在顶部被吸附剂吸附，然后，从柱顶部加入
6、作为洗脱剂的有机溶剂（流动相），由于吸附剂对各组分的吸附能力不同，各组分以不同速率下移，被吸附较弱的组分在流动相里的百分含量比吸附较强的组分要高，以较快的速率向下移动，而被吸附较强的组分则下移速率较慢，这样，样品中各组分经过反复多次的吸附洗脱而随溶剂以不同的时间从色谱柱下端流出，从而达到分离的目的。如果各组分为有色物质，则可直接观察到不同颜色的谱带。分离得到的各组分用不同容器盛取后，可进行定性、定量分析。由于色谱法经济、简便、高效、准确等，在药物分离分析中获得了广泛的应用。三、实验材料、试剂和设备1. 实验材料葛根，葛根素（8-D-葡萄吡喃糖-4，7-二羟基异黄酮）2. 实验试剂工业乙醇，正丁
7、醇（AR），无水乙醇（AR），甲醇（AR）3. 实验设备粉碎机，标准筛（10目），加热回流装置（1000 mL烧瓶、冷凝管、加热套、温度计、搅拌器），过滤装置（布氏漏斗、滤纸、抽滤瓶），分液漏斗，量筒，烧杯（50 mL、100 mL、500 mL），锥形瓶（100 mL），滴管，铁架台，旋转蒸发器，天平，容量瓶（100 mL、25mL），移液管（1 mL）；紫外分光光度计。四、实验内容本实验先用95乙醇从葛根中提取葛根素粗品，然后再用树脂吸附法对粗品进行分离纯化，具体实验操作流程如下：五、实验步骤1. D101型大网格吸附树脂的预处理大孔吸附树脂（macfofeticulaf resin）是六
8、十年代末发展起来的一类有机高聚物吸附剂，它具有多孔网状结构和较好的吸附性能。D-101型大孔吸附树脂是苯乙烯型弱极性共聚体，是一种多孔立体结构的聚合物吸附剂，是依靠它和吸附物之间的范德华力通过巨大比表面进行物理吸附。D-101具有物化性质稳定，对葛根异黄酮选择性吸附能力强、容易解析、再生简单、不容易老化、可反复使用等优点。把葛根醇提取液通过大孔吸附树脂，葛根素被吸附，而大量水溶性杂质随水流出，从而使葛根素与水溶性杂质分离。大网格聚合物吸附剂在使用前使用要预处理，特别是新购买的大网格聚合物吸附剂，含有许多脂溶性杂质。取50 g树脂，用95%乙醇溶液浸泡树脂24 h，充分溶胀后湿法装柱，以2 BV
9、/h的流速洗脱，至流出液与水混合（比例15）不呈混浊为止，再用蒸馏水洗至无醇味，备用。2. 葛根的预处理称取50g葛根，用粉碎机粉碎，过10目筛。将葛根粉末装入到提取瓶中，加入6倍量的95%乙醇，过夜。3. 葛根素的粗提用加热回流装置从葛根中提取葛根素，一共加热回流3次：第一次加6倍量的95%乙醇加热回流提取2 h，过滤；第二次滤渣加入4倍量的95%乙醇加热回流提取1.5 h，过滤；第三次滤渣加入2倍量的95%乙醇加热回流提取1 h，过滤。合并三次提取液，减压浓缩的粗提浸膏。4. 葛根素的分离将葛根素粗提物用适量的水溶解后，滤去不溶物，以2 BV/h的流速通过处理好的大孔树脂柱（吸附剂用量为粗
10、提物的7倍）。穿透液重复吸附3次，静置30 min。用蒸馏水洗去糖类、蛋白质、鞣质等水溶性杂质，至水清。改用70%乙醇洗脱（乙醇用量为粗提物的12倍），流速2 BV/h，收集洗脱液。浓缩回收乙醇至无醇味。5. 葛根素的精制洗脱液加等体积正丁醇萃取4次，合并正丁醇萃取液，回收正丁醇至干。6. 葛根素收率的测定将精制葛根素用甲醇溶解并定容至100 mL的容量瓶中。移取1 mL，用甲醇稀释至25 mL的容量瓶中，即为样品溶液。分析方法：（1）配制一系列葛根素为标准溶液（至少5个浓度梯度），以甲醇为空白，读取248nm下的紫外吸收值。以浓度为横坐标、吸收值为纵坐标，得线性回归方程，即为标准曲线。（2）
11、样品溶液，以甲醇为空白，读取248nm下的吸收值，利用标准曲线，计算溶液浓度C。 （mg/g）六、注意事项1. 树脂一定要在充分溶胀以后才能装柱。2. 预处理好的树脂，一直保持湿润，不能脱水。3. 实验结束后，树脂回收到指定的容器中。备注：1. 湿法装柱步骤装柱质量是确保柱层析分离效果的技术关键之一。无论是手工、机械、自动化装柱都是一样的，要求装入柱中的分离载体材料松紧适度，分布均匀，无气泡、无断层、无结节，能保持正常的溶胀形态和结构。一般采用湿法填充，一般步骤为：层析柱底部若没有石英砂，应放置少量玻璃丝或棉花；要求它们不漏不堵、不吸附样品，且能保持一定的流速；固定层析住，柱中加入1/5柱高的溶剂；树脂应充分溶胀。开始装柱时，应打开柱端阀门，并保持一定的流速。加入树脂，需连续、均匀，不要中断，使树脂颗粒均匀沉降，使不发生分层或倾斜；装柱之后，用溶剂充分洗涤，把树脂中的微粒、夹杂的尘埃溢流除去，同时驱逐树脂层的气泡，使树脂颗粒填充均匀。2.葛根标准品浓度与吸收值浓度C （mg/mL）0.0040.0080.0120.0160.020吸收值A0.4920.7921.0881.3901.70211
