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1、实验七 流式细胞仪检测技术免疫细胞是一组不均一的细胞群体。各种特定的细胞群其细胞表面表达有各自特异的表面标志分子，利用这些特异的表面标志，可以鉴定、分离和纯化相应的细胞群。随着单克隆抗体技术的诞生和免疫标记技术（特别是荧光标记技术）的发展，以及计算机科学的应用，使利用仪器的方法检测特异的细胞膜表面分子成为可能。本章介绍的荧光激活细胞分类技术就是采用单克隆抗体技术和免疫荧光标记技术，并结合光学检测和计算机分析技术而产生的鉴定和分离特定细胞亚群的技术。实验原理 流式细胞仪（flow cytometer）是一种能够探测和计数以单细胞液体流形式穿过激光束的细胞检测装置，由于在检测中使用的细胞标志示踪物
2、质为荧光标记物，因此，用来分离、鉴定细胞的流式细胞仪有被称为荧光激活细胞分类仪（fluorescence activated cell sorter,FACS）,是分离和鉴定细胞群及亚群的一种强而有力的应用工具。其原理是在一组混合的细胞群中，加入特异的针对特定靶细胞表面分子的荧光标记单克隆抗体，这种特异单克隆抗体与其对应的抗原靶分子结合，结合后的荧光标记抗体停留在特定细胞的表面，称为荧光抗体标记的靶细胞；将含有被标记细胞的混合细胞群混悬在一定容积的上样缓冲液中，再通过FACS的进样吸管孔，仪器就会将细胞悬液制成以单细胞排列的微细流束。当每一个细胞通过仪器的激光束照射时，带在细胞上的荧光就会被相
3、应的激光束激活并发出对应的荧光，通过敏感的光电倍增管即可检测到从细胞表面发出的荧光。根据测得的散射光（scattered light ）可得到细胞大小及颗粒状态的信息；而从荧光的发射强度(fluorescence emissions)则提供了结合在细胞上的抗体信息，进而也被反映了该细胞表面相应分子的表达情况。在流式细胞仪分离装置中，返回到计算机的信号，可用来产生一种电荷，这种电荷以特定准确的时间通过FACS的吸管孔，在与吸管孔的液体流相相遇时，可将液体流打碎成只含一个细胞的微滴。含有电荷的微滴就会从主液体流中偏移，穿过一双极板。带正电荷的微滴被吸引至阴极，而带负电荷的被吸引至阳极。以这种方式，
4、特定的细胞亚群由于标记着不同的荧光抗体而带有不同的电荷，从而将目的细胞从混合的细胞群中分拣出来。实验应用流式细胞仪主要有两个最基本的用途：第一是可以定量分析鉴定活细胞表面表达的特异分子，第二是进行特定的活细胞群的分离和纯化。1. 免疫细胞群的分类 静止淋巴细胞之间从其外观形态难以区分，都是以致密的核及少量细胞质组成的小而圆的细胞为特征。然而，这些细胞确是由功能各异的不同细胞亚群所组成，各种细胞群表达各自特殊的表面分子。例如,B淋巴细胞上表达有特异的膜表面免疫球蛋白（mIg），而成熟的T淋巴细胞表面表达特异的CD3分子。T淋巴细胞又可进一步按其表达的不同表面标志细分成不同的亚群，如CD4+CD8
5、-和CD4-CD8+亚群。因此，可由这些特征性的表面标志，将细胞分为不同的群或亚群。2. 免疫细胞的分化发育 免疫细胞分化发育的不同阶段，其表面标志也在不断地发生着变化。如胸腺细胞（发育过程中的T淋巴细胞），在发育的不同阶段从不成熟到成熟，其表面标志经历了从双阴性（CD4-CD8-）到双阳性（CD4-CD8-），直到单阳性（CD4+CD8-或CD4-CD8+）的过程。正常生理状态下，发育不同阶段的胸腺细胞以一定的比例存在于胸腺中。通过检测这些标志，即可判定某些因素（基因突变等）对胸腺细胞发育的影响。3. 免疫细胞的分子表达 免疫细胞的不同因素的影响下，其表达的分子也会发生变化。通过检测这些分子
6、的变化，可分析细胞功能以及细胞分化状态等。例如，静止的T淋巴细胞不表达或低水平表达CD69分子；而一经活化，其表达CD69分子数量明显增加。因此，可通过检测这些活化标志的变化来判定细胞状态以及研究影响细胞活化状态的因素。4. 免疫细胞的分离 如前所述，免疫细胞是一组极不均一的群体。所以在研究免疫细胞功能时，常常需要把某些特异的细胞分离和纯化。虽然免疫细胞分离的方法很多，但用FACS来纯化特定的细胞群是目前最为有效和方便的手段。例如，最近颇受关注的CD4+CD25+T淋巴细胞是一群具有免疫调节（免疫抑制）功能的细胞群。在对其特点及功能进行研究时，首要的问题是分离该细胞群。用相应的单克隆抗体与其结
7、合，再用FACS进行分离，就能得到纯度很高CD4+CD25+T淋巴细胞细胞群。而其他分离方法不仅分离过程烦琐，也很难控制无菌条件及保证细胞纯度。实验方法流式细胞仪的使用一般分为三个步骤。第一，是仪器前阶段，包括试剂的准备，细胞制备、细胞的荧光染色；第二，是流式细胞仪阶段，主要是仪器的操作；第三，是结果分析阶段。（一） 细胞和试剂的准备材料（1）细胞样品：来源淋巴细胞或外周血的白细胞。（2）荧光标记单克隆抗体：常用的有FITC（fluorescein -isothiocyanate）和PE(phycoerythrin)标记的单克隆抗体。（3）封闭抗体：抗Fc受体抗体 免疫细胞表面一般表达有Fc
8、受体，能和抗体的Fc段结合。封闭抗体的作用就是阻断荧光标记的单克隆抗体的Fc段与免疫细胞表面Fc受体结合所产生的非特异性的结果。（1） FACS缓冲液： 1PBS 950ml FCS 40ml 10%叠氮钠溶液 10ml（2） 仪器缓冲液（FACS-flow）：仪器厂家提供（3） FACS清洁液（FACS clean ）和FACS洗净液（FACS rinse）：仪器厂家提供。操作步骤（1） 单细胞悬液的制备：将11051107的细胞放入1.5ml离心管中3000r/min离心5分钟，弃上清；加入FACS缓冲液100l悬浮细胞。（2） 封闭细胞表面Fc受体：在步骤1中加入Fc受体抗体0.5l（0
9、.5mg/ml），水浴3分钟。（3） 细胞与荧光抗体结合：在步骤2中加入荧光抗体1l（0.5mg/ml），水浴30分钟。（4） 洗细胞去除游离的荧光抗体：在步骤3中加入FACS缓冲液350l，轻轻混匀，3000r/min，离心5分钟，弃上清，重复步骤（4）2次。（5） 上样前处理：取100l仪器缓冲液加入步骤（4）获得的细胞沉淀中，轻轻混匀悬浮细胞，将细胞悬液移入FACS专用管中，准备进行仪器检测和分析。（二） 仪器的操作以FACSCaliburTM(BD Biosciences)仪器为例。仪器主要分为主机部分（包括激光激活源，射流，射线探测器）和计算机部分（CELLQuest softwer
10、e）。仪器的操作分为使用前的准备、使用中的操作和使用后的清洗。1.使用前的准备（1）打开电源：包括系统电源和主机部分电源。（2）检查供液槽和废液槽：供液槽应含足够的仪器缓冲液，废液槽应在上次使用后清洗干净。（3）使机器处于负亚状态，才能使细胞悬液被吸入至机器的吸管口。（4）机器处于可应用状态时，指示灯会变成绿色。2.使用中的操作（1） 计算机部分使用CELLQuest程序系统软件：设定所要检测细胞的数量：一般设10 00020 000个细胞。命名本次实验：一般含使用者的姓名和实验日期。打开记数部分：显示进入的细胞数以及检测一定量的细胞所需要的时间。将微机与主机连接：控制检测时的预检测和实际检测
11、。主机设定：一般是已设定好的适合测定淋巴细胞的条件，包括探测器的电压。探测器的电压是调空光电倍增管所能检测荧光密度的范围。选择检测的波长和表达方式（plot）：如果用一种荧光抗体，一般选直方图（histogram）(表11-1)：如果用两种荧光抗体，常选点状二维图（dot plot）或轮廓线图（contour plot）表 CD69分子表达检测直方图的数值说明 a.anti-CD3(-)检测结果markerLeft,rightevents%gated%totalmeanGeo,meanCVmedianPeak ChAll1,991010000100.00100.0012.064.591453.
12、373.221M11,105996999.6999.698.044.53134.413.221M2105,9910310.310.311304.57309.78223.13164.00112b.abti-CD3(2ng/ml)检测结果markerLeft,rightevents%gated%totalmeanGeo,meanCVmedianPeak ChAll1,991010000100.00100.00200.5348.90193.6861.531M11,100577657.7657.7624.4111.69109.2212.861M2100,9910423742.3742.37440.31
13、344.57114.76361.90417c.abti-CD3(10ng/ml)检测结果markerLeft,rightevents%gated%totalmeanGeo,meanCVmedianPeak ChAll1,991010000100.00100.00236.9074.05155.88113.42495M11,90460246.0246.0225.1312.83101.6714.421M290,9910542554.2554.25415.81327.83102.28349.12495CD4及CD8细胞点状二维图结果quadevents%gated%totalXmeanXgeo.mea
14、nYmeanYgeo.meanUL161416.1416.143.682.99346.86291.03UR742574.2574.2599.3876.39308.36256.26LL5585.585.584.003.399.916.88LR4034.034.03123.3293.657.144.35不同的荧光物要求选择不同的激发波长，参见下表用于FACS的荧光物荧光物激发波长（nm）FITC525(green)PE575(orabge-red)RED613610(red)PI620(red)PerCP650(red)TRI-COLOR650(red)CyChrome670(red)(2)细胞的吸入：将装有细胞的FACS测定管放置到机器吸管孔处。先预检测样品，然后进行实际检测。可根据细胞的浓度选择测定的速度（低、中或高）。所有的数据将自动存入微机。3.使用后的清洗 所有样品测定完后，要进行仪器的清洗。（1）将装FACS清洁液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入1分钟。（2）将装FACS洗净液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入 1分钟。（3）再将装FACS清洁液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入5分钟。（4）同
