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1、端粒酶基本原理及技术方法摘要：近几年研究表明端粒酶与肿瘤的发生发展密切相关，推测可能是一个广泛的肿瘤标志物。本文就端粒酶活性检测的原理，端粒酶的提取方法，trapT增技术，四种结果分析方法(同位素法、染色法、荧光法和ELISA法)以及如何进行质量控制与半定量测定进行综述。端粒酶(Telomerase)是由RNAF口蛋白质组成的一种核糖核蛋白酶。人端粒酶RNAS分(hTR1于1995年被克隆，其中含有端粒重复序列 的模板(5 -CUAACCCUAAC-);蛋白质组分具有 RNAft赖的DN够 聚酶活性，结构尚不清楚。端粒酶能以自身RNA勺模板区为模板复制合成端粒序列。在胚性细胞等增殖活跃的细胞中
2、具有端粒酶活性，而在正常成熟体细胞中端粒酶失活，同时还发现绝大多数肿瘤细胞都呈端粒酶阳性，而在癌旁组织和正常组织阳性率很低，推测端粒酶可能是一个广泛的肿瘤标志物 1。因此近几年端粒酶在各种肿瘤中的研究日益深入，同时促进了检测方法的改进与完善。本文对其检测方法综述如下。1 基本原理端粒酶在体外可以以其自身 RNA勺模板区为模板，在适宜的寡核甘酸 链的末端添加6个碱基的重复序列，用聚丙烯酰胺(PAGE凝胶电泳 可显示6个碱基差异的梯带。1994年Kim建立了基于PCR1础上的端 粒重复序列扩增法( telomericrepeatamplificationprotocol,TRAP )。 TRA阪应
3、原理见下图。首先合成一个18nt的TS做上游引物，端粒酶结合TS末端的GTT并 合成 agggttag ，然后每经过一次转位合成一个ggttag 的 6 碱基重复序列，端粒酶灭活后，加入一个 24nt的CX做下游引物，经过多次变性- 退火 - 延伸，扩增端粒酶延伸产物。2 基本技术方法2.1 标本来源手术摘除组织，针吸活检组织，胸水，腹水，膀胱或胰 管冲洗液，棉拭子所取分泌物和尿液(尚有争议)等。2.2 端粒酶的提取方法早期采用超声等物理破碎的方法在不同细胞中的提取效率差异较大，此后采用去污剂(如CHAPS裂解的方法在少量细胞获取了较稳定的端粒酶提取液。现详述如下：40100m谈冻(-70%
4、C)组织或104106沉淀细胞用冰预冷的洗液10mMhepes- KOH(pH7.5),1.5mMMgCl2,10mMKCI,1MmDTT1 次，10000g4 c 离心 1min,沉淀加200“ 冷裂解液10mMtris-HCI(Ph7.5),1mMMgC12,1mMEGTA,0.1mMPMSF,5mM基乙醇，0.5 % CHAP，S 10甘油，自动匀浆器冰浴中匀浆，450rpm,25min,16000g4 离心20min,移取上清160区l ,部分样品用于蛋白定量，其余迅速冷 冻，- 70保存。端粒酶经小于10次冻融可保持活性稳定。部分学者对某些标本用0.5 % Tween-20代替0.5
5、 % CHAPS5得更好的效果2。2.3 TRAP扩增50TRAP体系包含 20mMtris-HCI(pH8.3) , 1.5mMMgCI 63mM,KCI,0.005%Tween-20, 1mMEGTA,50MdNTP 0.1 igtS, 1 gT4 基因32蛋白，0.1mg/ml牛血清白蛋白，12 wlCHAP*田胞提取液(含 6区 g)蛋白，0.2 0.4 “ -32PdGIP或-32PdGIP(10w Ci/屋,3000Ci/mmol),这一反应体系可同时满足端粒酶 Tap聚合酶的活性需要，23 C 10min合成端粒酶延伸产物后，94c 3s灭 活端粒酶，力口入 0.1 wgcX和
6、2UTaq酶，94C30s, 50C30s,72c1.5min扩增27个循环，25 l产物进行15% PAGE胶电泳。2.4 引物设计为了防止上、下游引物之间的结合，在CX引物上设计了3个不匹配碱基(见图1*处)，单链结合蛋白T4基因32蛋白可进一 步避免引物之间的结合，TS和CX引物被广为采用，在上述条件下，只 有延伸了三至更多的GGTTA咛断才有特异扩增，即得到从 40bp开始 的 6bp差异的梯带。Broccoli 等以 5 -GGCGCG(ACCCTA33-代替 CX 引物，由于增加了 G-C含量，可提高退火温度，进一步避免引物间的 结合，增加特异性3。Oncor公司设计RP引物代替C
7、X弓I物，得到从 50bp 开始的 6bp 差异的梯带 4 。3 扩增片断的检测3.1 同位素法Kim建立的方法即为同位素法，其应用最多。采用-32PdGTPg dCTPt入的报道很多，但部分学者用丫 -32PdATP和T4激酶标记TS引物的5端，发现更易于检出低水平的端粒酶，同时更易 定量3,5。PAGE5胶电泳后在X-光片上放射自显影或用Phosphoimager仪扫描测定3h。同位素法的优点是灵敏度高，100个永 生化细胞 27 个循环即可检出，缺点是存在放射性污染，且放射自显影需 8h 至两天以上时间，时间较长。3.2 染色法电泳后用SYBRgreen EB染色，然后紫外灯下观察或用
8、CCD0像系统测定4,6,7。EB在302nm紫外透射仪和桔红色紫外滤光片 下效果最好，可得与SYBRgree/目近的敏感性。染色法简便，快速， 灵敏度为 100 个永生化细胞30 个循环，由于染色带的信号强度不能精确反映其分子数（大片断染色更强），因此染色法只能判定相对端粒酶活性，而不能测定端粒酶延伸产物的确切数量。3.3 荧光法加入10pmol荧光素标记（如FAM FITC）的TS和/或CX 引物扩增，经8%的变性PAGE胶电泳，DNAM序仪自动读取数值， 片断管理系统软件自动计算扫描曲线的峰高和峰面积，从上样到出结果仅需90min。荧光系统极敏感，为避免过量扩增产物可能给出不可靠 结果，
9、要使用0.51.0 wg的低蛋白量，扩增27个循环，由于片断管 理系统能自动检出很微弱的荧光，因此不能精确测定低水平端粒酶活性811。荧光法的另一应用是于原位一TRA的析，可以在细胞水平 上检出端粒酶活性，因此可以判定是哪些细胞、多少细胞具有端粒酶活性，而裂解提取法不能知其活性的细胞来源。原位分析在硅化玻片上进行，荧光显微镜下观察结果。目前只用于新鲜标本，用冻存病理标本的实验尚不成功，需改进方法防止冻融中胞内端粒酶的分散及增加标本的渗透性等12。3.4 ELISA法TS引物5端标以生物素，PCFT增后，将产物变性，力口 入地高辛标记的可与扩增产物的重复片断特异结合的探针，杂交产物上的生物素与固
10、定在微孔板上的卵白素相结合，而探针上的地高辛与过氧化物酶标记的抗地高辛抗体结合，然后加入底物，显色后用酶标仪测定。ELISA法是宝灵曼试剂盒使用的方法，由于没有电泳，因此观 察不到 6bp 差异的梯带。4 质量控制4.1 排除假阳性设置以下四种对照（ 1） 85 10min 灭活端粒酶；（ 2） 端粒酶对RNas嗷感，0.5 wg/10 提取液+ 1 wgRNase 37C, 20min; （3）不加提取液；（4）不加CX或TS引物。以上实验可排除 引物二聚体或PCR亏染。4.2 排除假阴性（1）以阳性细胞沉淀（106 细胞）的裂解提取液为阳性对照进行TRAP分析可以排除由于试剂质量不好造成的
11、假阴性。（2） 组织提取液中 Taq 酶抑制物的存在会造成假阴性，为此Wright 等加入一个150bp的内标准。内标准的获得方法如下：设计TS加长引物：5 -AATCCGTCGAGCAGAGTTGTGAATGAGGCCTTCffl长引物：5- （CCCTTA）3CCCTAATAGGCGCTCAATGTA-别在 TS和 CX引物的 3端 增加15个碱基，可与编码鼠肌蛋白的 97132位氨基酸的碱基匹配， 扩增后得到150bp产物，柱纯化后备用。每个TRA版应加入15ag内 标为模板，TS和CX引物既可扩增端粒酶延伸产物，又可扩增150bp的内标，当无150bp 扩增带出现时说明存在Taq 酶抑
12、制剂，这对内标为众多学者所采用。也有其它学者采用200bp或36bp的内标4,8,14。（ 3）稀释提取液可降低酶抑制物浓度，扩增带从无到有说明含酶抑制物。为了减少甚至排除某些标本中存在的抑制物的影响，许多学者在得到端粒酶延伸产物后进行酚-氯仿 -异戊醇（ 25： 24： 1）抽提，酒精沉淀纯化 14,15 。5 端粒酶活性的半定量检测由于端粒酶活性在少数正常组织细胞中有微弱的表达，而且与细胞的增殖活跃程度、肿瘤的恶变程度及预后等有关，因此半定量测定端粒酶活性在临床应用上意义重大。简便的方法是通过10 倍稀释提取液以有无 6bp 差异的梯带产物为标准。在任何稀释度下无产物为（ - ）；不稀释下
13、有产物为（+）；10 倍稀释下有产物为（+）；100倍稀释下有产物为（+）,还可再进行1000倍稀释1618。Wright等将内标引 入后使端粒酶活性的半定量检测成为可能，将6bp 差异的梯带强度总和和除以内标的强度进行标准化后，在1011000个细胞间具有很好的线性关系，而无内标时在大于 300 个细胞即进入平台。许多学者采用这种方法描述相对端粒酶活性 18,19。Oncor试剂盒（1996年第2版） 提供了更为准确的方法，用 Phosphoimager仪扫描测定凝胶信号，TPG （TotalproductGenerated ，总生成产物）单位=（x-x0）/c ） / （r-r0）/c ）
14、 x 100（TSR8为0.1amol）,其中x代表无热灭活处理标本管中 梯带信号总和；x0代表热灭活管信号；r代表TSR8质控管梯带信号总 和，TSR8是人工合成的寡核甘酸链，由于 TS连接AG（GGTTAG涸成； r0代表无标本的裂解液对照管信号；c和cR分别代表无热灭活处理标 本管和TSR8质控管中内对照的信号，每个 TPGII位相当于1X10- 3amol或600个TS引物分子30 C, 10min延伸至少4个端粒重复序列 的数量，在1300TPG（相当于约3010000个阳性对照细胞中所含端 粒酶活性）范围内成线性。5 小结kim建立了 TRA防法为端粒酶活性的检测提供了一个有力的手段，此 后许多学者又进行了改进，尤其是内标的引入使得借助某些分析仪可以进行较精确的半定量测定。四种结果分析方法中，同位素法灵敏度高，但存在放射性污染，临床推广有一定难度；荧光法虽需进口的贵重仪器，但其敏感、快速、自动化程度最高，且易于半定量；染色法和ELISA法简便、快速，结合稀释法可以进行简单的半定量，后三种 方法均有应用前景。端粒酶基本原理及技术方法
