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1、黑曲霉发酵生产柠檬酸生产工艺优化摘要柠檬酸(2-羟基丙烷三羧酸)，是重要的工业原料。可从植物原料中提取，也可由糖进 行发酵制得。实验研究了不同硫酸铵浓度分别对黑曲霉摇瓶发酵和实罐发酵生产柠檬酸的影 响。在菌浓度、发酵过程PH、酸度、残糖、温度在发酵过程中的变化几个方面对实罐和摇 瓶发酵进行了相关比较。结果表明：1)摇瓶发酵的最适硫酸铵浓度为 0.4%；实罐发酵最适 硫酸铵浓度为 0.5%，实罐发酵时硫酸铵浓度过高将产生大量泡沫不利发酵；2)实罐发酵与 摇瓶发酵在起始含糖量、菌浓度及发酵温度相同的情况下，随发酵进行，摇瓶发酵的温度更 稳定，两者的菌浓度、残糖、 PH 值变化规律高度一致，酸度变化
2、规律基本一致。另外实验 还就温度对黑曲霉发酵生产柠檬酸的影响作用进行了探讨，结果表明实罐发酵的最适温度约 为35C，温度过高会导致发酵液水分流失过多而使发酵失败。 关键词：黑曲霉，柠檬酸，硫酸铵，实罐，摇瓶AbstractCitric acid(2-hydroxytricarboxylic acid), is an important industrial raw material. It can be extracted from plant materials or be obtained by fermentation of sugar. In this treatise, we stu
3、died the different impacts to the fermentations in erlenmeyers and fermenters which were made by the different concentration of the ammonium sulfate. We compared the differences between the fermentation in erlenmeyers and fermenters by analyzing the concentration of the bacteria, the PH during the f
4、ermentation process, acidity, residual sugar and the temperature changes during the fermentation process. The results showed that: 1) the optimum concentration of ammonium sulfate for the fermentation in erlenmeyer is 0.4% while the optimum concentration of ammonium sulfate for the fermentation in f
5、ermenters is 0.5%.when the concentration of ammonium sulfate is too high, the fermentation cannot be succeed for the large number of foam. 2) when the initial sugar content, bacteria concentration and fermentation temperature are under the same circumstances, the fermentation in the erlenmeyer has m
6、ore stable fermentation temperature. Both the two methods of fermentations have the same variation in the concentration of the bacteria ,residual sugar, PH value and changes of acidity. Another experiment also studied the influence to the fermentation in the fermenter made by temperature. The result
7、 showed that the production of citric acid from the fermentation of Aspergillus niger is the highest when the temperature is 35C ,when the temperature is too high , fermentation will fail for the excessive loss of water. Keywords：citric acid, Aspergillus niger, fermentation, erlenmeyer, fermenter, a
8、mmonium sulfate1. 课题背景1.1 柠檬酸简介1柠檬酸(citric acid)是生物体主要代谢产物之一，在自然界中分布很广，主要存在于柠 檬、柑橘、菠萝、梅、李、梨、桃、无花果等果实中，尤以未成熟者含量居多。柠檬酸又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸（2-hydroxytricarboxylic acid）、2-羟基丙烷 -1,2,3-三羧酸（ 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid）。分子式：C6H8O7 （相对分子质量：192.13）物理性质：无色透明或半透明晶体，或粒状、微粒状粉末，虽有强烈酸味，但令人愉快， 稍有涩味。极易溶于
9、水，溶解度随温度的升高而增大。化学性质：从结构上讲柠檬酸是一种三羧酸类化合物，并因此而与其他羧酸有相似的物 理和化学性质。加热至175 C时它会分解产生二氧化碳和水，剩余一些白色晶体。柠檬酸 是一种较强的有机酸，有3个H+可以电离；加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油等 发生反应。1.2 柠檬酸用途2柠檬酸被称为第一食用酸味剂，极广泛地用作酸味剂、增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂等， 用于饮料、糖果、酿造酒、冰淇淋、酸奶、罐头食品、豆制品与调味品等的生产中。另外， 在药物、美容品、化妆品工业上也有着重要的应用。它是香料和饮料的酸化剂，在食品和医 学上用作多价螯合剂，同时是化学中间体，用于制造药物，也
10、可用于金属清洁剂、媒染剂等 3。柠檬酸的盐类、酯类和衍生物也各具特点，用途极为广泛而有良好的发展前景。1.3 柠檬酸循环（ citric acid cycle） 4又称三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle），克雷布斯循环（Krebs cycle）。体内物质糖、月旨 肪或氨基酸有氧氧化的主要过程。通过生成的乙酰辅酶 A 与草酰乙酸缩合生成三羧酸（柠 檬酸）开始，再通过一系列氧化步骤产生C02、NADH及FADH2，最后仍生成草酰乙酸，进 行再循环，从而为细胞提供了降解乙酰基而提供产生能量的基础。由克雷布斯（Krebs）于 20 世纪30年代最先提出。1.4 实验发酵机理1
11、）以薯干粉、玉米粉或淀粉等糖类为原料经黑曲霉柠檬酸产生菌（我们采用黑曲霉 M288）糖化后产生高浓度的葡萄糖。2）、黑曲霉利用糖类发酵产生柠檬酸：葡萄糖以EMP （糖酵解途径或者）、HMP （磷酸 戊糖循环）两种途径产生丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧形成乙酰CoA，另一方面经CO2 固定化反应后生成草酰乙酸，最后草酰乙酸和乙酰CoA缩合产生柠檬酸。3）生理调节：柠檬酸是黑曲霉的良好碳源，故柠檬酸的积累是菌体代谢失调的结果。 1） Mn2+抑制蛋白质合成造成NH4+的浓度增大，从而解除对PFK的抑制，使EMP通畅；2）柠 檬酸脱氢酶在柠檬酸浓度高的情况下活性降低，进一步促进柠檬酸的积累。1.5 发
12、酵方法2发酵有固态发酵、液态浅盘发酵和深层发酵 3 种方法。固态发酵是以薯干粉、淀粉粕 以及含淀粉的农副产品为原料，配好培养基后，在常压下蒸煮，冷却至接种温度，接入种曲， 装入曲盘，在一定温度和湿度条件下发酵。采用固态发酵生产柠檬酸，设备简单，操作容易。 液态浅盘发酵多以糖蜜为原料，其生产方法是将灭菌的培养液通过管道转入一个个发酵盘 中，接入菌种，待菌体繁殖形成菌膜后添加糖液发酵。发酵时要求在发酵室内通入无菌空气。 深层发酵生产柠檬酸的主体设备是发酵罐。微生物在这个密闭容器内繁殖与发酵。现多采用 通用发酵罐。它的主要部件包括罐体、搅拌器、冷却装置、空气分布装置、消泡器，轴封及 其他附属装置。发
13、酵罐径高比例一般是1:2.5，应能承受一定的压力,并有良好的密封性。除 通用式发酵罐外，还可采用带升式发酵罐、塔式发酵罐和喷射自吸式发酵罐等。为了得到产柠檬酸的优良菌种，通常是从不同地区采集的土壤或从腐烂的水果中分离筛 选，然后通过物理和化学方法进行菌种选育。例如薯干粉深层发酵柠檬酸的菌种就是通过 柠檬酸不断变异和选育得到的。菌种适合在高浓度下发酵，产酸水平较高。1.6 黑曲霉菌柠檬酸发酵的影响因素2柠檬酸的发酵因菌种、工艺、原料而异，但在发酵过程中还需要掌握一定的温度、通风 量及pH值等条件。一般认为，黑曲霉适合在2830C时产酸。温度过高会导致菌体大量繁 殖，糖被大量消耗以致产酸降低，同时
14、还生成较多的草酸和葡萄糖酸；温度过低则发酵时间 延长。微生物生成柠檬酸要求低pH,最适pH为24,这不仅有利于生成柠檬酸，减少草 酸等杂酸的形成，同时可避免杂菌的污染。柠檬酸发酵要求较强的通风条件，有利于在发酵 液中维持一定的溶解氧量。通风和搅拌是增加培养基内溶解氧的主要方法。随着菌体生成， 发酵液中的溶解氧会逐渐降低，从而抑制了柠檬酸的合成。采用增加空气流速及搅拌速度的 方法，使培养液中溶解氧达到60饱和度对产酸有利。柠檬酸生成和菌体形态有密切关系， 若发酵后期形成正常的菌球体，有利于降低发酵液粘度而增加溶解氧，因而产酸就高；若出 现异状菌丝体，而且菌体大量繁殖，造成溶解氧降低，使产酸迅速下
15、降。尽管经过几十年的研究5，关于柠檬酸发酵机制仍然有很多不够了解的地方，柠檬酸的 合成积累涉及到一系列的酶，它们是相互关联的，影响制约柠檬酸发酵的因子也是多种多样 的，发酵液中金属离子的含量对柠檬酸的合成有非常重要的作用，过量的金属离子引起产酸 率的降低，铁离子能刺激乌头酸水合酶的活性，从而影响柠檬酸的积累。柠檬酸发酵用的糖 蜜原料，因含有大量金属离子，必须应用离子交换法或添加亚铁氰化钾脱铁方能使用。然而 微量的锌、铜离子又可以促进产酸。相对来说，发酵培养基中的金属离子以及小分子量的有 机物是比较容易控制的因子。但是每种因子的影响不是绝对的，如金属离子 Fe2+ 、Mn2+ 等， 他们并不是可
16、以无条件降低其浓度，同时它们也是微生物其它正常代谢途径中必须因子，我 们只能寻找一个最合适于柠檬酸发酵的浓度。资料表明6789:高浓度Mn2+将刺激乙酰辅酶A,造成草酰乙酸浓度下降，不利于合 成柠檬酸。铜离子能抑制柠檬酸裂解酶活力6，培养基中加 Cu2+ ，有利于达到最高柠檬酸 产量。柠檬酸在顺乌头酸酶的催化下转化为顺乌头酸，进而转化为异柠檬酸，Fe2+是乌头酸 水合酶专一激活剂，但柠檬酸发酵开始时，需要少量铁存在以促进菌体生长和为柠檬酸合成 作准备，随后要控制 Fe2+ 的存在才能开始并大量积累柠檬酸。 Johnson 等在研究黑曲霉的 CO2 固定作用时发现有两个 CO2 固定系统，这两个系统需要 Mg2+、K +71112 。也有说几种 常见的金属离子对柠檬酸合成酶的抑制作用，且 Ca2+ Mg2+ Na+ K+ ，当然还与离子强度有 关。AMP、无机磷和NH4+对磷酸果糖激酶(PFK)有活
