免疫学技术实验指导

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1、免疫学技术实验指导目录第一章抗原获取与抗体的制备 3实验一 免疫球蛋白的分离与纯化 4实验二 动物免疫与佐剂制备 6第二章体外抗原抗体反应及其应用 8实验三 凝集抑制试验妊娠试验 9实验四 双向琼脂扩散试验免疫球蛋白鉴定10实验五 免疫电泳免疫球蛋白鉴定 11第三章免疫标记技术 12实验六 荧光抗体标记 13实验七 酶联免疫吸附试验（ELISA）双抗体夹心法.14实验八 酶联免疫吸附试验（ELISA）间接法15第四章免疫细胞的检测 17实验九 外周血单个核细胞的分离密度梯度离心法18实验十 外周血T细胞的数量检测一E-花环形成试验.20 实验十一 淋巴细胞表面抗原检测免疫荧光法22实验十二 细

2、胞膜表面抗原检测补体依赖的微量淋巴细胞 毒试验 23实验十三 NK 细胞杀伤功能检测25第五章 细胞因子检测 26实验十四 肿瘤坏死因子检测27附录：免疫学技术实验常用试剂配方29第一章 抗原获取与抗体的制备在以抗原和抗体的特异性结合为基础的免疫学应用技术中，抗原的获取与抗体 的制备构成了免疫应用技术的重要基础。在经典的免疫学技术中，抗原的获取通常是指从复杂的有机体或多种混合组分 中分离出特定的抗原成分，以使被免疫机体的免疫应答局限化，提高反应的特异性。 在此过程中通常使用的技术包括了组织分离与破碎、离心技术、各种层析以及以盐 析为代表的多种选择性沉淀技术。而在以半抗原制备免疫原的过程中，则还

3、需涉及 到载体联接等生化反应技术。在经典的抗体制备过程中，通常以免疫动物作为制备多克隆抗体的有效途径。 这一过程牵涉到如何选择动物，怎样进行免疫接种和佐剂的制备使用等问题。而在 现代免疫学技术中以杂交瘤技术制备单克隆抗体，则更要依赖于细胞培养、细胞融 合、选择性培养和克隆化技术等许多实验方法。因此，在抗原的获取与抗体的制备这一章中，牵涉到了许多有关生物化学、免 疫学以及细胞生物学的技术。而掌握这些技术除了需要的学习外，更需要反复的实 践。本章实验由于时间与各种条件的限制，仅能向同学们提供一个基本的概貌和一 些力所能及的实验操作，希望通过理论与方法的介绍和初步的实验操作，同学们能 举一反三，完成

4、如下的学习要求：1 掌握抗原纯化的目的意义及各类免疫原制备的原则。2 掌握单克隆抗体制备与纯化的一般过程及方法原理。3 掌握杂交瘤技术的基本原理4熟悉特异性抗体的制备过程 5熟悉佐剂的原理与制备 6 了解免疫动物的基本方法及注意事项实验一 免疫球蛋白的分离与纯化一、原理 盐析法：利用蛋白质的胶体性质，在蛋白质溶液中加入一定量的中性盐类（如 （NH4）2SO4、Na2SO4 等），使蛋白质脱水及降低颗粒表面电势，溶解度随之降低， 使蛋白质从溶液中析出，此即称为盐析作用。不同浓度的中性盐可分别将不同蛋 白质组分析出，达到分离之目的。沉淀（免疫）球蛋白的硫酸铵的最适饱和度为 33%。凝胶过滤法：凝胶

5、柱是以多孔网状结构凝胶作层析介质。凝胶具有海绵状立 体网孔结构，孔径较一致，犹如分子筛，故本法又有分子筛层析法之称。当不同 大小分子的混合物加至柱表面时，大分子物质不能进入胶粒的网孔内，在胶粒之 间的空隙中向下移动，首先被洗脱，而小分子物质则进入胶粒的网孔内而反复受 阻，向下移动速度慢而后被洗脱，因而使混合物中分子大小不同物质顺序流出柱 外，达到分离不同大小分子混合物的目的。二、器材与试剂1器材（1）磁力搅拌器、铁立架、蝴蝶夹、层析柱、离心机、紫外分光光度计（2）试管、烧杯、滴管、吸管、透析袋、烧瓶、洗耳球（3）座标纸、记号笔、橡皮筋、pH试纸2试剂（ 1 ）正常血清（ 2） 葡聚糖凝胶（ S

6、ephadex G-75）（3）饱和硫酸铵（pH7.8）、生理盐水（4）pH8.0，0.005M 磷酸缓冲液（ 5 ） FITC+Blue DEXTRAN 2000 混合物三、操作步骤【盐析法】11ml 正常血清加等量生理盐水稀释，混匀。2. 在稀释血清内逐滴加入2ml饱和硫酸铵溶液，边滴边搅拌，使其充分混匀，直 至加完（此时硫酸铵饱和浓度为50%）,然后置4C冰箱30分钟，使蛋白质充 分沉淀。3. 将上述样品离心（3000rpm） 15分钟，弃去上清夜。4. 沉淀物用少量生理盐水（约2ml）溶解，然后逐滴加入饱和硫酸铵溶液1ml （此 时硫酸铵饱和浓度为33%），然后置4C冰箱30分钟，使其

7、沉淀。5. 将沉淀样品离心（3000rpm） 15分钟，弃去上清夜。6. 沉淀物用少量生理盐水（约1.5-2m l）溶解。7. 将上述溶解后的样品装入透析袋并扎紧，流动自来水冲洗透析40 分钟，然后 置生理盐水中透析（放冰箱）至无NH4+存在为止（用奈氏试剂滴入透析液中， 无黄色沉淀出现即可），此样品即为粗制免疫球蛋白。【凝胶过滤法】1. 将玻璃层析柱垂直于铁立架上，于柱内加入约 1/3 柱高的 pH8.0， 0.005M PB 缓冲液，赶尽孔腔内的气泡，关紧止水夹。2. 将经过缓冲液平衡过的Sephadex G-75凝胶轻轻搅匀，沿管壁缓缓加满层析柱， 待凝胶下沉压积约1 cm高度时打开止水

8、夹，控制流速为2030滴/分。3. 将凝胶不断搅匀加入层析柱，直至凝胶沉积面离管口 45 cm为止。4接上 pH8.0， 0.005M PB 洗脱缓冲液，流穿层析柱平衡45 分钟。5. 将样品上柱，洗脱（注意控制流速 20 滴/分），观察分层情况，收集先流下的 Blue DEXTRAN。四、操作注意事项1. 盐析时注意需将饱和硫酸铵逐滴加入稀释血清内，并迅速摇匀。2. 注意区别前后两次盐析所加的饱和硫酸铵含量。3. 注意装柱时的正确操作，检查层析柱是否均匀，有无气泡、裂隙，凝胶沉积面 是否平整。4. 上样、洗脱时应做到“前切”、“后切”。“前切”指柱顶缓冲液于凝胶平面相切 时再加样品；“后切”

9、指待样品走至于凝胶平面相切时再加入洗脱缓冲液。五、实验结果记录与分析实验二 动物免疫与佐剂制备一、原理以特定抗原免疫动物，经多次增强免疫后，可从动物血清中获得特异性抗体。 此种免疫应答在有佐剂参与的情况下可得到大幅度增强。目前常用的佐剂为福氏 完全佐剂，是由石蜡油、羊毛脂与卡介苗组成的油包水乳液。被免疫的动物，其免疫注射部位的引流淋巴结可因免疫应答反应而明显肿 大。解剖动物淋巴结切片中可观察到初级淋巴滤泡转化成次级淋巴滤泡，有生发 中心生成。若将淋巴结内细胞制成涂片，染色后可观察到淋巴母细胞的存在。二、器材与试剂1器材（1）小烧杯、搅拌器、磁珠、平皿（2）OT 注射器、4 号针头（3）动物解剖

10、板、眼科镊子、眼科剪刀、载玻片（4）显微镜2试剂（1）石蜡油、羊毛脂、卡介苗（2）牛血清白蛋白（3） Hanks 液（4）瑞氏染液（5）小鼠、免疫一周后小鼠三、操作步骤（一）含佐剂抗原的制备 1 称取 10g 羊毛脂加入 40ml 石蜡油，15 磅 15 分钟高压。 2 取上述混合液 10ml 至烧杯内，加入卡介苗一支混匀。 3取上述混合液 10ml 放入另一烧杯内，加搅拌珠在搅拌器上搅拌，同时取牛血 清白蛋白（抗原）1ml逐滴加入烧杯内，搅至混合物成白色油包水乳液为止。（二）免疫动物4将已制成的含佐剂抗原吸入 OT 注射器。5. 取小鼠固定于解剖板，分别在鼠尾根部上方1 cm处与右足底趾间皮

11、下注射 4050含佐剂抗原。（三）免疫后动物引流淋巴结观察6. 取另一免疫一周后小鼠处死，并固定于动物解剖板上。7. 从腹正中剪开小鼠皮肤，固定于两侧，寻找肿大的腹股沟淋巴结，并取出置平 皿中。8. 将腘窝处皮肤剪开，在腘窝软组织中寻找肿大淋巴结，取出置平皿中。9. 打开腹腔将内脏推向上方，在腹主动脉两侧寻找腹腔淋巴结，取出置平皿中。10. 观察淋巴结的大小、形态。11. 将淋巴结剪成两半，用小镊子在干净载玻片上作涂片。12. 待涂片干燥后，用瑞氏染液染色后在显微镜下观察。四、操作注意事项1. 免疫小鼠时应注意避开血管。2. 注射时，应小心掌握好抗原剂量。3. 取出腹主动脉两侧淋巴结时，应注意

12、避免损伤血管，影响手术视野。五、实验结果记录与分析1 含佐剂抗原的制备 取一滴制备好的抗原滴在水面上，观察其扩散情况，以不马上扩散、不和水 混合的状态为油包水乳液，表示该抗原符合标准。2 免疫动物 判断注射的抗原是否进入皮下，观察并描述鼠尾根部及足底趾间注射局部的 形态。3 引流淋巴结观察 比较左右腘窝淋巴结的大小及形态。 从淋巴结涂片中寻找淋巴母细胞并做出正确描述。第二章 体外抗原抗体反应及其应用体外的抗原抗体反应在经典的血清学反应中主要包括凝集反应、沉淀反应、补 体参与的反应和中和反应四大类。这些反应主要利用了抗原抗体特异结合的原理以 及抗原抗体结合的合适比例理论，使抗原抗体复合物在某些特

13、定条件下能被肉眼所 观察到。其中尤以凝集反应与沉淀反应最为经典和常用。凝集反应是指颗粒性抗原与相应抗体混合时，给予适当条件则可出现大小不等 凝集块的现象。依据这一现象所设计的凝集试验，可分为两大类：一类是颗粒性抗 原与抗体直接反应叫做直接凝集试验；另一类则是将可溶性抗原事先吸附于颗粒载 体表面，制成致敏载体颗粒，再与相应抗体反应，称为间接凝集试验。沉淀反应则是指可溶性抗原与相应抗体在有电解质存在的情况下，按适当比例 所形成的可见沉淀物现象。据此现象设计的沉淀试验主要包括絮状沉淀试验、环状 沉淀试验和凝胶内的沉淀试验三大类。凝胶内的沉淀试验依所用的实验方法又可分 为扩散试验和电泳技术两类。在一些

14、实验设计中穿插了这两类技术，构成了许多种 不同的实验类型。经典的血清学反应通常用于抗原抗体的定性、定量测定，以及对抗原抗体成分 的分析、比较与鉴定。这些试验具有操作简单、实用，结果容易观察等优点，但其 灵敏度和分辨性常受到方法自身的限制。本章实验内容是一些最为经典的凝集与沉淀试验，希望同学们通过这些实验与 相应的理论学习能完成下列要求：1 掌握体外抗原抗体反应的特点及影响因素2 掌握各类经典的血清学反应的基本概念与实验原理3 熟悉常用的凝集、沉淀试验的方法与结果分析4 了解血清学反应的一般应用实验三 凝集抑制试验妊娠试验一、原理 聚苯乙烯乳胶颗粒具有吸附蛋白质类生物高分子的性能。利用它作为载体

15、，直接吸附抗原（如绒毛膜促性腺激素，HCG）成为致敏乳胶颗粒。将抗体先与标 本中的抗原结合，然后再加入致敏乳胶颗粒，如不出现凝集现象，说明标本中的 抗原中和了抗体，结果为阳性；若标本中无抗原物质，则抗体与加入的致敏乳胶 颗粒结合，出现凝集，结果为阴性。此法作为早期妊娠诊断的有效方法，具有快 速、简便、准确等优点。二、器材与试剂1器材（1）载玻片（2） 50卩1微量移液器（3）移液头（4）牙签（5）黑纸2试剂（1）致敏HCG乳胶试剂（ 2）抗 HCG 抗体（ 3）孕妇尿（ 4）正常尿三、操作步骤1 取载玻片二块，一块加孕妇尿50卩1，另一块加正常尿50卩1。2各加一滴抗HCG抗体，用牙签搅动，使其充分混匀，均匀分布于载玻片上。3. 再加致敏HCG乳胶抗原一滴，轻轻摇动35分钟，在较强的光线下、黑纸背 景上，边摇动边观察结果。4阴性：出现均匀一致的细小凝集颗粒。阳性：仍现乳状液体，无凝集颗粒。四、操作注意事项1 几种试剂的加入顺序，应照操作步骤进行，否则结果难以判断。2 所用搅拌的牙签应注意一头只能搅拌一个标本。