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1、烟草转基因准备工具：EP管灭菌无菌水Ms培养基75%的酒精（蓝口小瓶）升汞（要回收）1ml枪枪头EP管架计时器一、转基因（1）无菌条件下，将烟草种子放入EP管中用无菌水冲洗2-3次； 于75%的酒精中浸泡30-60sec；（3）再用0.1%的升汞处理5min，最后用无菌水冲洗5次；（4）播种于MS培养基上，培养在杭州师范大学生命与环境科学院植物学重点实 验室组织培养室中，暗培养4天。25C光照培养20-30天。MS培养基 pH5.8（5）待烟草苗长至3-5cm时（20-30天），取顶芽放于MS+BA0.2mg/L （壮芽，使 其快速成长）培养基上，继代培养。（6）继代培养14天后（有小叶片即可
2、），取叶片，大小1cmX1cm，切去叶柄，叶 片表面及叶边缘划伤，放入MS+ BA1.0mg/L pH6.0-6.5的预培养培养基上， 正面朝下紧贴培养基放置，于黑暗条件下预培养2-3天。（7）然后取出预培养的叶片或茎段，放入侵染液中进行侵染。侵染前一天晚上， 摇菌农杆菌2瓶。将2ml离心管装满菌液，4000rpm离心5min，用悬菌液清洗两次。以1:10 比例（10ml悬菌液放1管1.5ml菌体）放入悬菌液，加入As25mg/L （40ml 中加 40ulAs）不断摇晃侵染液，使其与叶片及茎段切口处充分接触，10min后，取出，放 于灭过菌的干燥滤纸上吸干菌液；(8) 将叶片及茎段放回到预培
3、养基上，28C黑暗条件下共培养2-3天，至叶片切 口周围有微菌斑形成；洗菌，取出共培养的烟草叶片及茎段，用添加500mg/LCef的无菌水冲洗5 次，第一次放置于摇床摇30min，后面每次5min，以洗去外植体表面的农杆 菌；(10) 取出后，用滤纸吸干，转移到烟草诱芽培养基上，诱芽培养基为MS+ BA 1.0mg/L + Hyg25mg/L + Cef 500mg/L pH5.8；过2周观察，如果发现不长菌，则降低Cef浓度。如果长菌，则继续保持 Cef浓度。(11) 每两周更换一次培养基，直至长出不定芽(一般情况为2周)。切下再生的 小苗(1cm 左右)，转入继代培养基 MS+ BA0.2
4、-0.1mg/L+ Hyg25mg/L + Cef500mg/L pH5.8(12) 至小苗长至2cm长时(有小芽即可)，转接入生根培养基MS+ NAA0.2-0.1mg/L上，24 士 1C、12h光照、1500lx培养三周左右即可长出 粗壮根系。(13) 对生根的植株进行PCR初步检测，将结果呈阳性的植株经过炼苗后移到泥 炭：蛭石=7:1的基质中，放入人工气候室进行培养，并对其生长情况进行观 察、记录。农杆菌侵染液的制备(1)取-80C冰箱保存的含有表达载体的农杆菌，划平板培养，LB固体平板中加 入 50mg/L Kan 和 50mg/L Rif； 挑取单菌斑到含50mg/L Kan和50
5、mg/L Rif的5mL LB液体培养基中，放入 摇床中28C、200rpm培养过夜(12h-16h)； 保存菌种，750ul菌液加入灭过菌的甘油250ul，-80C冰箱保存备用。(4) 摇菌，LB液体培养基10ml加Kan (所需浓度50mg/L) 10ul、Rif (所需浓 度 50mg/L) 10ul 及菌液 10ul，28C、200rpm 过夜培养(12h-16h)。(5) 当菌液浓度达到OD600=1.5左右时，取2mL菌液加入到离心管中，4000rpm离心5min；（6）倒掉上清液，吸1mL新的MS液体培养基，重悬农杆菌，4000rpm离心5min。重复步骤（6） 一次；（8）用1
6、mL的MS液体培养基重悬菌后，再加入到40mL的MS的液体培养基中（含40ul 25mg/L的As），即为侵染液。放置2h以上，再侵染。200ml悬菌液20x 大量 10ml200x 有机 1ml200x 铁盐 1ml200x 微量 1ml蔗糖5.6g二、烟草转化Hyg筛选压的确定因为所构建的载体具有潮霉素（Hygromycin,Hyg）抗性，所以转基因过程中 需用Hyg进行抗性苗的筛选。以MS培养基为基础，添加不同Hyg浓度梯度进行试验，共设7个Hyg梯 度：0 mg/L、5mg/L、10 mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L、30mg/L。取烟草叶 片或茎段划伤口后分别接种到潮霉素的诱芽培养基中（40-45天），30天后观察 受体材料生长情况，统计外植体的出芽率，选择可以抑制受体材料生长的最低 Hyg浓度作为筛选压。（70-75天。）最终Hyg筛选浓度为25mg/L。
