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1、基因工程药物的研发分为上游和下游两个时期：上游时期:要紧是分离目的基因、构建工程菌（细胞）。目的基因获得 后，最要紧的确实是目的基因的表达。选择基因表达系统要紧考虑的 是保证表达的蛋白质的功能，其次是表达的量和分离纯化的难易。现 在期的工作要紧在实验室内完成。下游时期:从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量操纵。现在期是将实验室的成果产业化、商品化，要紧包括工程菌大规模发 酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的 开发，分离纯化的优化操纵，高纯度产品的制备技术，生物传感器等 一系列仪器外表的设计和制造，电子运算机的优化操纵等。血管抑制素（angiostatin，简称A
2、GN）是纤溶酶原 的一个酶解片段，相当于其14 Kringle区,具有抑 制内皮细胞增殖、抑制血管生成及抑制多种类型肿 瘤生长和转移的生物功能,是一种新型血管生成抑 制因子1 , 2 ,关于操纵肿瘤、糖尿病视网膜病变、消 化道溃疡、关节炎等病理性血管生成具有重要的研 究价值和应用前景.PCR产物的T载体克隆（一）重组T质粒的构建一原理外源DNA与载体分子的连接确实是DNA重组，如此重新组合的DNA叫做重组体或重组子。 重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将 分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA 连接酶和
3、大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分 子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性,即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低， 一样可通过提高 T4 噬菌体 DNA 连接酶浓度或增加 DNA 浓度来提高平末端的连接效率。 T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步：第一，T4 DNA连接酶与辅因子ATP 形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5磷酸基和3羟基切口的DNA 上, 使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同
4、大小的片断相连。因为DNA片断有两个端点，因此切割时显现两种可能，一种是单酶切， 另一种是双酶切，这两种酶切方法在基因工程操作中都经常用到。关于单酶切来说，载体与 供体的末端都相同，连接能够在任何末端之间进行，如此就导致了大量的自连接产物。为了 减少自环的高本底，可对载体进行5除磷酸处理，原理是连接酶只能连接DNA片断的3OH 末端与 5端，因此除磷后载体可不能自环。一旦有外源片断插入时，由外源片断提供5端 就能与载体进行连接。通过这种方法可大大减少由载体的自 环造成的高本底。关于双酶切来说，不管载体与供体同一片段上都有不同的末端，如此就幸 免了载体与供体的自环，能使有效连接产物大大增加。双酶
5、切的另一个特点是能将供体分子 定向连接到载体上。连接反应的温度在37C时有利于连接酶的活性。然而在那个温度下粘末端的氢键结合是不 稳固的。因此采取折中的温度，即12-16C，连接12-16h (过夜)，如此既可最大限度地发 挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳固TaqDNA酶扩增的PCR产物，其DNA 双链前后末端都有一个游离的 A 碱基，能够与 pGEM-T Easy Vector 末端游离的 T 碱基互补 形成环状重组T质粒。二材料与方法1 材料外源DNA片断2 仪器、用具 移液枪、碎冰3 试剂pMD 18-T Vector； Ligation buffer； T4 ligatease
6、； rATP4 方法连接体系如下：16C连接过夜。(二) 重组质粒的转化及阳性克隆的鉴定1 材料E.coli JM109 菌株2 仪器、用具超净工作台、离心机、恒温摇床、恒温培养箱、培养皿、试管、1.5ml离心管、电泳仪、电 泳槽、凝胶样品梳、移液器3 试剂(1) CaCl2、LB平板(见附录)；SOC培养基(见附录)；SOB培养基(2) RNase A1； Buffer S1； Buffer S2； Buffer S3； Buffer W1；无水乙醇的 Buffer W2a(3) 1x电泳缓冲液(TAE)；溴化乙锭溶液(EB)有毒，小心；琼脂糖；6x加样缓冲液(4) 酚；氯仿；异戊醇(5)
7、ddH2O； 10xPCR Buffer (Mg2+ plus)； dNTP； M13+； M13-； TaKaRa rTaq酶4 方法1. 大肠杆菌感受态细胞的制备(1)取大肠杆菌JM109储存液50卩1,接种于4ml LB (或SOB)液体培养基中，37C, 300rpm 振荡培养过夜，翌日取50卩1转接到新的4ml LB (或SOB)液体培养基中扩大培养3h至 OD600=0.350.4,在无菌操作台上取1ml菌液于1.5ml离心管中，冰浴10min。4C, 5000rpm离心2min,去上清液。 加入750卩1预冷的0.1M CaCl2重悬菌体，冰浴30min。4C, 5000rpm离
8、心2min,弃上清液。 加入100卩1冰冷的0.1M CaCl2轻轻重悬菌体，冰浴2h后，4C储存备用。2.重组DNA的转化(1)将含 Amp、X-Gal、IPTG 的 LB 平板 37C预热。 于100卩1感受态细胞中加入10皿连接产物，冰浴30min。(3)将离心管转入42C水浴，热冲击90秒，然后不要摇动离心管，迅速将其放在冰上2min。 在离心管中加入SOC培养基300卩1，枪头混匀，37C、150rpm温顺摇振60min。(5)将 200卩1 转化菌液平均地涂布于含 50mg/mlAmp、20mg/ml X-gal、200mg/ml IPTG 的 LB平板上，37C倒置培养过夜，选择
9、白色菌落进行鉴定。注意事项： 制备感受态细胞的全部操作均须于冰浴操作，同时注意近火无菌操作，防止感受态细胞 受杂菌污染。 42C热处理时专门关键，转移速度要快，且温度要准确。 菌液涂皿操作时，应幸免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化，过多的机 械挤压涂布会使细胞破裂，阻碍转化率。3 重组质粒的鉴定方案一 菌落 PCR(1) 制备PCR混合液：(2) 用经灭菌的10卩1枪头(不用牙签)挑去白色菌落，迅速地使挑取物溶在上述混合液中(3) 盖上离心管得盖子，在沸水上温育10 min。将步骤的样品冷却至室温，离心数秒，然后于管中加入TaKaRa rTaq酶0.25ul。(5)按以下条件进行P
10、CR反应：94C预变性3min；然后进行30个循环反应，其温度循环条 件为：94C变性1min, 57C退火1min, 72 C延伸1min；循环终止后72C再延伸5min。 取5卩1 PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。方案二 质粒 PCR1. 碱裂解法少量制备质粒 DNA(1)用离心管收集4ml在LB培养基(含Amp)中培养过夜的菌液，14000rpm离心30秒， 弃尽上清。 用250卩1已加入RNase A1的Buffer S1充分悬浮细菌沉淀。 加入250卩1 Buffer S2,温顺但充分地上下翻转混合4-6次，此步骤不宜超过5min。*Buffer S2使用后应赶忙盖紧瓶盖，
11、以免空气中的CO2中和Buffer S2中的NaOH,降低溶 菌效率。 加入400卩1 Buffer S3,温顺地上下翻转8-10次，室温静置2min, 14000rpm离心10min。 *若离心后凝聚块未沉淀到离心管底部，应再上下翻转数次，12000g离心3min。(5) 将 DNA-prep Tube 置于 2-ml Microfuge Tube 中，将步中的混合液移入 DNA-prep Tube 中，5500rpm 离心 lmin。(6) 弃滤液，将 DNA-prep Tube 置回到原 2-ml Microfuge Tube 中，加入 500卩1 Buffer W1, 5500rpm
12、离心 1min。(7) 弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中，加入700卩1已加无水乙醇 的Buffer W2， 5500rpm离心1min,以同样的方法再用7001已加无水乙醇的BufferW2洗涤一次。(8) 弃滤液，将 DNA-prep Tube置回到原 2-ml Microfuge Tube 中，14000rpm 离心 1min。连滤液一并弃掉收集管，将DNA-prep Tube置于一新的1.5ml离心管中，在silica膜 中央加入25-30卩1 Eluent或去离子水。(10) 室温静置 2 min， 14000rpm 离心 1min
13、 洗脱 DNA。(11) 取5gL样品，1%琼脂糖凝胶电泳初步选择重组转化子。2. 抽提纯化质粒DNA酚、氯仿抽提能够去除碱裂解法制备的质粒DNA中残留的蛋白质。(1)加TE稀释质粒DNA溶液至300yL。 加等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),震荡混匀，静置3min。14000rpm离心5min，吸上清液，加等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，混匀，静置3min。 14000rpm离心5min，吸上清液，加等体积的氯仿:异戊醇(24:1),混匀，静置3min。14000rpm离心5min，吸上清液，加2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀后-20C放置15min， 沉淀质粒DNA。
14、14000rpm离心13min，弃上清液，沉淀加入200yL 70%乙醇洗涤一次，室温干燥，用20yL 去离子双蒸水溶解质粒DNA沉淀，-20C储存待用。(7)取5卩1样品，1%琼脂糖凝胶电泳检测纯化结果。3. 质粒PCR(1) PCR反应体系如下：(2) PCR扩增反应条件：94C预变性3min；然后进行30个循环反应，其温度循环条件为： 94C变性1min, 57C退火1min, 72 C延伸1min；循环终止后72C再延伸5min。(3) 取5卩1 PCR产物于1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，方法与试验二相同。PCR产物克隆大致分为两类，平滑末端连接和粘性末端连接，平滑末端比粘性末端的连接效
15、率要 低专门多。平滑末端连接：载体为平末端，可用EcoR V或Sma I酶切，同时为了防止载体自连，对载体做了去磷酸处理。PCR产物为磷酸化的平末端产物：一样高保真聚合酶扩增得到，高保真聚合酶有专门强的 3-5外切酶活性。或将非平末端的PCR产物使用DNA聚合酶进行平末端处理。关于平末端的 PCR产物还需要进行磷酸化处理，使其5磷酸化。粘性末端连接：1、酶切克隆：在 PCR 引物的 5端引入与载体匹配，不同识别位点的限制性内酶切位点，载体 使用同样的限制性内切酶酶切，进行连接，通常能够得到定向克隆的结果。2、TA克隆：TA克隆系统由Invitrogen公司（San Diego, CA）进展而来的商业性试剂盒，它用 PCR产物的克隆和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3末端加上一个非模板依靠的 A,而T载体是一种带有3T突出端的载体，在连接酶作用下，能够快速地、一步到位地把PCR 产物直截了当插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中。TA克隆没有方向性。聚合酶链式反应科技名词定义中文名称：聚合酶链式反应英文名称：polymerase chain reaction;PCR定义 1：用引物和DNA聚合酶进行体外扩增特定的DNA区域的一种技术。所属学科：生态学（一级学科） ；分子生态学（二级
