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1、附件2专业技能训练（）指导书课程类别: 专业必修课适用对象:室内检测/环境工程专业（三年学制）独立实践学时：54一、实训内容及要求实验一、普通光学显微镜的构造和使用实训要求：（一）学习普通光学显微镜的结构、各部分功能及使用方法。（二）学习并掌握油镜的原理和使用方法。 （三）需提交资料 实训结束时，学生需要提供以下资料：1.细菌标本的观察绘制图稿。2.实验报告。 实验二、培养基的制备实训要求：（一） 学习制备培养基的基本技术（二） 制备牛肉膏蛋白琼脂培养基 （三）需提交资料 实训结束时，学生需要提交实验报告。实验三、干热灭菌及高压蒸汽灭菌实训要求：（一）了解干热灭菌及高压蒸汽灭菌的操作方法。 （
2、二）需提交资料 实训结束时，学生需要提交实验报告。实验四、细菌的革兰氏染色实训要求：（一） 掌握染色的原理和操作过程、掌握简单染色和革兰氏染色法（二） 熟悉显微镜的使用技术 （三）需提交资料 实训结束时，学生需要提交实验报告。实验五、大肠菌群的测定实训要求：（一）学习大肠菌群的测定方法（二）学会使用大肠菌群最可能数检索表 （三）需提交资料 实训结束时，学生需要提交实验报告。二、实训过程（含步骤）实验一、普通光学显微镜的构造和使用一、目的与要求（一）学习普通光学显微镜的结构、各部分功能及使用方法。（二）学习并掌握油镜的原理和使用方法。二、原理普通光学显微镱由机械装置和光学系统2大部分构成。在光学
3、系统中，物镱的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。而在普通光学显微镜中配置的几种物镱以油镱的放大倍数最大，与其它物镜相比，使用较特殊，需在载玻片与镜头之间加滴镜油，以增加照明亮度和提高分辨率。三、材料与仪器（一）菌种金黄色葡萄球菌及枯草杆菌染色玻片标本，啤酒酵母水浸片。（二）其他 香柏油、二甲苯、显微镱、擦镜纸。四、操作步骤 （一）显微镜的安置置显微镜于平整的实验台上，镜座距实验台边缘34cm，镱检时姿势要端正。（二）调节光源安装在镜座内的光源灯可通过调节电压以获得适当的照明亮度，而使用反光镱采集自然光或灯光作为照明光源时，应根据光源的强度及所用物镜的放大倍数选用凹面或平面反光镜度调节其
4、角度，使视野内的光线均匀，亮度适宜。 （三）低倍镜观察 将标本玻片置于载物台上，用标本夹住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方，下降10物镜，使其接过标本，用粗调节器（粗调螺旋）慢慢升起镜筒，出现图像后再用细调节器（细调螺旋）调节图像至清晰。通过标本夹推进器慢慢移动玻片，认真观察标本各部位，找到合适目的物，仔细观察。 （四）高倍镜观察 在低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心后转动物镜转换器将高倍镜移至工作位置，以聚光镜器光圈及视野进行适当调节后微调细调节器使物象清晰，利用推进器移动标本仔细观察并记录。（五）油镜观察 在低倍镜或高倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高约2厘
5、米，然后在待观察区域滴加12滴香柏油，将油镜转到工作位置，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接，将聚光器升至最高位置并开足光圈，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物象并用细调节器使其清晰为止。（六）显微镜用后处理1、上升镜筒，取下载片。2、用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯擦去镜头上残留的油迹，然后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。3、用擦镜纸清洁其他物镜和目镜，用绸布清洁显微镜的金属部件。4、将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八字形”再向下旋，同时把聚光镜降下，以免物镜与聚光镜发生碰撞危险。五、实验报告（一）结果分别绘出在
6、不同物镜下观察到的不同的菌种的形态，同时注明放大倍数。（二）思考题1油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？2显微镜中调节光线强弱的装置有哪些？实验二、培养基的制备一、目的与要求（一）学习制备培养基的基本技术。（二）制备牛肉膏蛋白琼脂培养基。二、原理 牛肉膏蛋白培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌培养基，这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，可供作繁殖之用，制作固体培养基时须加2%琼脂，培养细菌时，应用稀酸或稀碱将PH调至中性或微碱性。牛肉膏蛋白培养基的配方：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl0.5%，pH7.47.6。三、材料与仪器（一）试剂牛肉膏，蛋白胨
7、、NaCl、琼脂、1mol/L NaOH、1mol/L HCl。(二)其他试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，漏斗，乳胶管，弹簧夹，纱布，棉花，牛皮纸，线绳，pH试纸，电炉，台称。四、操作步骤（一）称量根据用量按比例依次称取成分，牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯，蛋白胨易吸湿，称量时要迅速。（二）溶解在烧杯中加入少于所需要的水量，加热，ZHU一加入各成分，使其溶解，琼脂在溶液煮沸后加入，融化过程需不断搅拌。加热时应注意火力，勿使培养基烧焦或溢出。溶好后，补足所需水分。（三）调PH 用1mol/L NaOH或1mol/L HCl把PH调至所需范围。（四）过滤趁热用滤纸或
8、多层纱布过滤，以利于某些实验结果的观察，如无特殊要求时可省去此步骤。（五）分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三解瓶内，分装装置如实验图8所示；分装时注意，勿使培养基沾染在容器口上，以免沾染棉塞引起污染。1液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜，分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的1/2为宜。2固体分装 分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面，斜面长度不超过管长的1/2。分装三解瓶，以不超过容积的1/2为宜。3半固体分装装置以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。（六）加棉塞分装完毕后，在试管口或三解瓶口塞上棉塞（或泡沫塑料塞及试管帽等，以阻止外界
9、微生物进入培养基而造成污染，并保证有良好的通气性能。 （七）包扎棉塞头上包一层牛皮纸，扎紧，即可进行灭菌。（八）保存灭菌后的培养基放入37养箱中培养24小时，以检验灭菌的效果，无污染方可使用。五、实验报告（一）结果说明你配制培养基过程中的情况。（二）思考题1培养基配制时应注意什么问题？为什么？2分装培养基时为什么要使用弹簧夹？3培养基配好后，为什么要立即灭菌？实验三、干热灭菌及高压蒸汽灭菌一、目的与要求了解干热灭菌及高压蒸汽灭菌的操作方法。二、原理干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白凝固变性而达到灭菌的目的，细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则
10、蛋白凝固越快，反之含水量越小凝固越慢。因此与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高（160170），时间长（12h）。高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放入一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅内水沸腾产生蒸汽，水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于水蒸汽不能溢出而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点升高，得到高于100的温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。一般培养基用0.1MPa、121.1. 1530min可达到彻底灭菌,灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变. 三、材料与仪器吸管、培养皿、试管、电热干燥箱，手提试高压蒸汽灭锅，
11、牛肉膏蛋白胨培养基、蒸馏水。四、操作步骤（一）干热灭菌法适用于空的、干燥的玻璃器皿的灭菌。培养基不适用。1将包好的待灭菌物品（培养皿、试管、吸管等）放入电热干燥箱（注意留有一定的间隙），关好箱门。2接通电源，打开排气孔，使箱内湿空气能逸出，旋动恒温调节器，保持加热升温状态，至箱内达到100时关闭排气孔。3当温度升到160170时，借恒温调节器的自动控制，保持此温度2h。 4切断电源，冷却至70时，打开箱门，取出灭菌物品（未降至70度以前，切勿打开箱门，否则温度骤降导致玻璃器皿炸裂）。（二）高压蒸汽灭菌1首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角架相平为宜。2放回内层锅，并装入待灭
12、菌物品（内装培养基或小的三角瓶），不要装得太挤，以免妨碍汽流通影响灭菌效果，三角瓶口不要与桶壁接触，以免冷凝水淋温包口的纸而透入棉塞。加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内，再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个棉栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。 3用电炉或其他方法加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气，待冷空气排尽后，关上排气阀让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升，当锅内达到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。 4停止加热，待压力表的压力降至零位时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。注意：当压力不为零时，不能开盖取物否则由于压力突然下降，容器内外压力不平衡而冲
13、出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染而发生污染，甚至灼伤操作者。5高压灭菌锅上的安全阀，是保障安全使用的重要机构，不得随意调节。五、实验报告（一）结果检杳灭菌是否彻底。（二）思考题1干热灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么？2为什么干热灭菌所需温度要比湿热灭菌高？ 3高压蒸汽灭菌时，为什么要排尽锅内的空气？ 实训四 细菌的革兰氏染色一、目的与要求（一）掌握染色的原理和操作过程（二）掌握简单染色和革兰氏染色法（三）熟练显微镜的使用技术二、原理由于菌体极小，折光率低，在显微镜下不容易看清，如将其染色，使菌体和背景之间反差增大，折光率增强，就容易看清，简单染色法只用一种染料着色。革兰氏染色法是细菌染色中一
14、种重要的鉴别染色法。通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌和阴性菌两大类。其过程是：草酸铵结晶紫初染路哥尔氏碘液媒染95%乙醇脱色蕃红花红复染。若细胞能保持结晶紫与碘所形成的复合物而不被乙醇脱色，则细菌呈紫色，称革兰氏阳性菌，若被乙醇脱色而被蕃红复染成红色，则称革兰氏阴性菌，三、材料与仪器（一）革兰氏染色液（草酸铵结晶紫液路哥尔氏碘液95%乙醇蕃红花红）、蒸馏水、菌落培养物（培养1824小时）、二甲苯、香柏油 （二）载玻片、盖玻片、酒精灯、废液缸、洗瓶、吸水纸、接种环、显微镜、镊子 （三）金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌（1216h），大肠杆菌。四、操作程序（一）简单染色法涂片干燥固定染色水洗干燥镜检1涂片取洁净载玻片，在中央滴一滴生理盐水（或无菌水），用接种环以无菌操作挑取欲观察菌体，和水充分混匀，涂成极薄的菌膜。2干燥室温自然干燥或略微加热干燥。3固定涂面朝上，快速通过火焰23次（勿使涂片烫手）。4染色放平染料，用自来水冲洗，直到涂片上流下的水无色为止。6干燥自然干燥或吸水纸吸干，或用电吹风吹干。 （二）革兰氏染色法涂片干燥固定草酸铵结晶紫初染水洗碘液媒染95%酒精脱色2030秒水洗蕃红花红液复染水洗干燥镜检1涂片：先滴一小滴蒸馏水于载玻片中央，然后用接种环取少量菌体轻轻混入水中，涂成一薄层并使细胞均匀分散。2干燥：在空气中令其自然干燥或在酒精灯火焰上端高处微微加温但勿靠近火焰
