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1、聚丙烯酰胺凝胶电泳作用：用于分离蛋白质和寡 糖核苷酸。作用原理 聚丙烯酰胺凝胶 为网状结构，具有分子筛效 应。它有两种形式：非变性聚丙 烯酰胺凝胶 及SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE ）；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋 白质能够保 持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量 而逐渐呈梯度分开。而 SDS-PAGE 仅根据 蛋白质亚基分子量的 不同就可以分开蛋 白质。该技术最初由 shapiro 于 1967 年建立，他们发现在 样品介质和丙烯酰 胺凝胶中加入离子 去污剂和强还原剂后， 蛋白质亚基 的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因
2、素）。作用SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去 折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间 的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后 的氨基酸侧 链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷 大大超过了蛋白原有 的电荷量，这样就 消除了不 同分子间的电荷差异和结构差异。SDS-PAGE 一般采用的是不连续缓冲系统，于连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过 大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个
3、狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电极 液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质 带负电荷，因此一起向正极 移动，其中氯离子 最快，甘氨酸根离子 最慢，蛋白居中。电泳开始时 氯离子泳动率最大，超过蛋 白，因此在后面形 成低电导区，而电场 强度与低电导区成 反比，因而 产生较高的电场强度，使蛋 白和甘氨酸根离子 迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白 聚集在移动 界面附近，浓缩成一中间层。此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要 取决于它的相对分 子质量，而与所带电荷和分子形状无关。聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE （ Polyacry
4、lamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作 为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯 酰胺凝胶由单体丙 烯酰胺和甲叉双丙烯 酰胺聚合而成，聚 合过程由自 由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（AP） 为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED ）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基， 后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三 维网状结构。PAGE 根据其 有无浓缩效应 ，分为连续系 统和不连续系 统两大类，连 续系统电泳体 系中缓冲 液 pH 值及凝胶浓 度相同，
5、带电颗粒在电 场作用下，主要靠电荷 和分子筛效应。不连续 系统中由于 缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳 动不仅有电荷效应， 分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分 离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极 缓冲液、浓缩 胶及分离胶所组成。浓 缩胶是由 AP 催化聚合而成的 大孔胶，凝胶缓冲液 为 pH6.7 的 Tris-HCl 。分离胶是 由 AP 催化聚合 而成的小孔胶，凝胶 缓冲液为 pH8.9 Tris-HCl 。 电极缓冲液 是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝 胶孔径、 pH
6、值、缓冲 液离子成分的不连续 性，这是样品浓缩 的主要因素。过程蛋白质在聚丙烯酰胺凝 胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净 电荷以及分子的大 小 和形状 等因素。如果加入一种试剂 使电荷因素消除，那电泳迁移率就取决 于分子的大小，就 可以用电泳 技术测定蛋白质的分子量。1967年，Shapiro等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS ）具有这 种作用。当向蛋白质溶液中 加入足够量SDS和巯基乙醇，SDS可使蛋白质分子中的二硫 键还原。 由于十二烷基硫酸根带负电，使各种 蛋白 质一SDS复合物都带上相同密度的负 电荷，它的量大大 超过了蛋白质分子原的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差
7、别，SDS与蛋白质结合 后，还可引起 构象改 变，蛋白质一 SDS复合物形成近似“雪 茄烟”形的长椭圆棒，不 同蛋白质的 SDS复合物的短轴长度都一样，约为18A，这样的蛋白质一SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再 受蛋白质原的电荷和形状的 影响，而取决于分 子量的大小由于蛋白 质一SDS复合物在单位 长度上 带有相等的电荷，所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶，进入分离胶后，由于聚丙烯 酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋 白质则受到较大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分 离。因而SDS聚丙烯酰胺 凝胶
8、电泳可以用于 测定蛋白质的分子量。当分子量在15KD到200KD之间 时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量， X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得 一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得 分子量。SDS 一聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测，纯化的蛋白质通常在SDS电 泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不 同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各 个亚基的几条带。SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度，一般只需要不到
9、微克量级的蛋白 质， 而且通过电 泳还可以同 时得到关于分 子量的情况 ，这些信息 对于了解未 知蛋白及设 计提纯过 程都是非 常重要的。常见问题及分析1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？在SDS - PAGE不连续电泳中，制胶缓冲 液使用的是Tris HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7， 分离胶pH8.9 ；而电泳缓冲液 使用的Tris一甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性， 因此甘氨酸解离很少，其 在电场的作用下，泳动效率低；而 CL离子却很高，两者之间形成导电性 较低的区带，蛋白分子就介 于二者之间泳动。由于导电性与电场强 度成反比，这一区 带便形成了 较高的电压梯度，压着蛋白质
10、分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由 于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分 离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决 问题的情况，应首要考虑该 因素。2. 样品如何处理？根据样品分离目的不同，主要有三种处理 方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基 化作用的还原SDS处理。1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT （或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被 解离，电荷被中和，形成SD
11、S与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳 均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。2）带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护 SH基团，得到较窄的 谱带；另碘乙酸胺可 捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现 象。100ul样 品缓冲液中10ul 20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。3）非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加 还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？聚
12、丙烯酰胺的作用：丙 烯酰胺与为蛋白质 电泳提供载体，其凝 固的好坏直接关系 到电泳成功 与否，与促凝剂及环境密切相关；制胶缓冲液：浓缩胶 选择PH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris - HCL系统，TEMED与AP: AP 提供自由基，TEMED是催化剂，催 化自由基引起的聚 合反应进行；十二烷基磺酸钠（SDS ）:阴离 子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去 多肽折叠。4. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温 下放置一段时间使用。忌即 配即用或4度冰箱放置
13、，前者易导致凝 固不充分，后者可 导致SDS结 晶。一般凝胶可在室温下保 存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具 体可参照郭尧君编著的蛋 白质电泳技术手册P82-103。5. “微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？主要是由于凝胶的中间 部分凝固不均匀所 致，多出现于较厚的 凝胶中。处理办法：待其充分凝固再作后续实验。6. “皱眉”（两边向下中间鼓 起）形带原因？主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。7. 为什么带出现拖尾 现象？主要是样品融解
14、效果不佳或分离胶浓度过大引起的。处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长， 重新配制；降低凝胶浓度。8. 为什么带出现纹理现象？主要是样品不溶性颗粒引起的。处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。9. 什么是“鬼带”，如何处理？“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中） 的一些大分子未知条带或加 样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中 被氧化而失去活性， 致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反
15、应中可见其能与 目标条带对应的抗体作用。处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可 加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。10. 为什么溴酚蓝不能起到指示作用？我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和 分离胶的浓度有关。处理办法：更换正确pH值的Buffer ；降低分离胶的浓度。11. 为什么电泳的条带很粗？电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7）；适当降低电压；12. 为什么电泳电压很高而电流却很低呢？这种现象一般初学者易 出现。比如电压5
16、0v以上，可电流却在5mA以下。主要是由于电泳槽 没有正确装配，电流未形成 通路。包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体 未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。处理办法：电泳槽正确装配即可。13. 浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？这主要出现在初学者中，一般对电泳不会 有太大的影响。前者 主要原因是拔梳子 用力不均匀 或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。14. 凝胶时间不对，或慢或快，怎么回事？通常胶在30MIN-1H内凝。如果凝的太慢，可能 是TEMED，APS剂量不够或 者失效。APS应该 现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成 黄色。 如果凝的太快，可能 是APS和TEMED用量过多，此 时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。15. 电泳时间比正常要长？可能由于凝胶
