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1、试剂的配制和器皿的灭菌：亚克隆试剂储液配制一览表：名称储存浓度储存条件Ampicillin100mg/ml分装为1ml，-20Co葡萄糖lmol/L0.22um滤膜过滤除菌，分装为1ml，-20CX-gal20mg/ml二甲基甲酰胺溶解，分装为1ml，用铝箔包裹，-20C。IPTG20%0.22um滤膜过滤除菌，分装为1ml，-20C。1. 培养基的配制和保存:1） LB 液体培养基的配制和保存：100ml200 ml500 ml1000 ml胰化蛋白胨（g）12510酵母提取物（g）0.512.55氯化钠（g）12510用容积适当的三角锥瓶盛放 LB 液体培养基，用滤菌膜封住瓶口，高温高压
2、灭菌，冷却后，放置于4C保存，备用。2） LB 固体培养基的配制和保存：100ml200 ml500 ml1000 ml胰化蛋白胨（g）12510酵母提取物（g）0.512.55氯化钠（g）12510琼脂粉（g）1.537.515用容积适当的三角锥瓶盛放 LB 固体培养基，用滤菌膜封住瓶口，高温高压灭菌，冷却后，标记为Amp-,放置于4C保存，备用。亦可以稍冷却一段时间至60C （微烫，尚可以忍受）时，立刻配制平板（培 养皿已提前灭菌，烘干）。在超净工作台中风吹4h,或者在烘箱中烘干。平板制 好后，用灭菌的塑料袋密封，标记为Amp-放置于4C保存，备用。用预先离心的 1.5ml 离心管分装 8
3、00ul1.0ml 左右灭菌的液体培养基，按照 1ul Amp/lml培养基的比例，加入Ampicillin,标记为Amp+放置于4C保存，备 用。4)LB固体培养基(Amp +)的制备和保存：灭菌后的固体培养基，冷却至50C左右时，分装一部分至另一灭菌备用的 三角锥瓶中，按照75ul/100ml加入Ampicillin (100mg/ml)，倒入培养皿，制备 Amp+平板，将培养皿盖子打开一点，以避免水珠凝结。待Amp+平板凝固，加入适当体积的X-gal和IPTG混合液(用时混合)，用 涂布棒涂布均匀，放置于超净工作台风吹4h,或者放置于烘箱中烘干。用已经灭菌的大小合适的塑料袋把做好的平板密
4、圭寸，标记为Amp+,放置于 4 C保存，备用。2. 葡萄糖溶液的配制和保存：配制1 mol/L的葡萄糖溶液，经过过滤除菌，分装为1ml，冻于-20C，备用。3. X-gal 和 IPTG 溶液的配制和保存：1) X-gal 溶液的配制和保存：X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-卩-D半乳糖苷。用二甲基甲酰胺溶解X-gal，配置 成 20mg/ml 的储存液。使用玻璃或聚丙烯管保存储存液。装有 X-gal 溶液的试管 需用铝箔包裹，防止因光照而被破坏，并储存于-20C。2) IPTG 溶液的配制和保存：IPTG为异丙基硫代P-D半乳糖苷。用8ml蒸馏水溶解2gIPTG，用蒸馏水 定容至10m
5、l，配置成20%的溶液。用0.22um过滤器过滤除菌。分装为1ml1份， -20 C保存。3) X-gal 和 IPTG 直接用于琼脂板：涂布 X-gal 的时候应特别小心，培养板中央的克隆由于 X-gal 浓度的差异也 许会产生更深的蓝色。具体操作：a、在含有氨苄的预制90mm琼脂板（LB）中央滴加40ul 2%X-gal和7ul 20%IPTG。如用 150mm 培养基，则应加入 100ul2%X-gal 和 20 ul 20% IPTG。b、用无菌涂布棒均匀涂布X-gal,使之分散于培养板整个表面。于37C 温育直至全部液体消失（由于二甲基甲酰胺挥发性低，如用新鲜琼 脂板，这一过程要持续
6、 34h）。c、接种后，待接种液完全吸收，将平板倒置于37C培养12 19hd、取出培养板，在4C放置数小时，使蓝色在这一期间充分显色。4. Amp 溶液的配制和保存：配制 100mg/ml Ampicillin 溶液， 0.22um 过滤除菌。分装成 1ml 左右， -20C 保存。5. 转化缓冲液（1XTSS）的制备：1 X TSS溶液的配制：85%高压灭菌的LB液体培养基、10%聚乙二醇 （PEG，wt/vol, MW3350）、5% DMSO （vol/vol）和 50mM MgC12 （pH6.5）将除LB液体培养基以外的成分混合，0.22um过滤除菌，然后高压灭菌的 LB液体培养基
7、混和，置于4C保存，可保存6个月。二、感受态细胞的制备：1. 从-70C中拿出冻存的DH5a菌株，不待融化，迅速用牙签（接种环） 挑取一些冰渣，在LB培养板（Amp-）上划线，37C培养过夜。2. 挑取1个单菌落，放入100ml的盛放于250ml三角锥瓶中的LB液体 培养基（Amp-）中，37C，220rpm摇菌过夜。3. 对上述菌液测量OD值在0.4 0.5之间时，取出锥瓶，转入50ml离心 管，置冰上， 4C， 3000rpm， 10minuts 离心收集细胞，将上清液倒尽。4.加入10ml预先冰冷的TSS溶液在冰上重悬细胞。勿使细胞下沉，迅 速将感受态细胞悬液分装为100u 1/管，丢入
8、液氮速冻，并转移到-70C 冰箱储存备用。三、PCR 产物的纯化：按照Qiagen胶回收试剂盒说明书进行操作。四、PCR 产物的连接：按照 pMD-19T 载体试剂盒说明书进行操作。Vector0.3ul (50ng /ul)Insert DNA1ulDDW1.2ulLigate mixture2.5ulTotal5.0ul将上述试剂在冰上混合后，立刻放置于4C连接过夜或者16C连接8h。然 后放置于4C,备用。五、重组质粒的转化：1. 将保存于-70C的感受态细胞取出放置于冰上解冻，并立即加入5u1连接 产物，并在冰上放置 60min。2. 42C热激90sec，立刻冰浴2min。3. 向转
9、化后的细菌中加入780U1LB液体培养基和20u1 1M葡萄糖储液。室 温下， 150rpm 温和摇菌 30min， 37C 200rpm 摇菌 30min。六、重组菌株的培养和阳性克隆的筛选：1、重组菌株的培养将复苏后的重组细菌在常温下，4000rpm离心5min，吸取800u1澄清LB 液体培养基。用200u1黄枪头，小心吹打离心后的细菌，使成悬液，并将其加入到预先冻存的LB平板（Amp+,含X-gal和IPTG）。用涂布棒小心涂布均匀，在超净工作台中放置（半开盖），待菌液完全被吸收（约10分钟），倒置于37C生化培养箱中培养1218h。2、阳性克隆的筛选取出培养基，在冰箱中4C放置数小时，直到显现蓝色菌斑。用灭菌牙签挑取白色菌斑，在10ul反应体系（载体测序引物与扩增cDNA 特异引物组合）PCR管内蘸洗12次，然后再在事先标记好的培养皿的方格区 域内接种4 5个菌落（注意PCR管和培养皿方格标记一致，培养皿标记方式如 下图，牙签回收灭菌，重复利用。培养菌的同时，做菌落 PCR。菌落 PCR 做完，1.2的琼脂糖凝胶进行电泳，根据目的条带大小确定阳性 克隆菌斑并判断DNA插入的方向，并在对应的培养皿的方格上做标记（如上图）。挑选已标记的阳性菌斑，放入800ul LB液体培养基（Amp+）中于37 C 300rpm 摇菌数小时。扩大培养的菌液亚克隆测序。
