质粒DNA的碱裂解法提取与纯化

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1、质粒DNA的碱裂解法提取与纯化细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从lkb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于 细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体 外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并 通过细胞分裂传递到后代。质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分 子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒 DNA 的方法，其基本原理为：当菌体在 NaOH 和 SDS溶液中裂解时，蛋白质与

2、DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性, 呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯 -溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方 法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀 等简单步骤去除残余蛋白质和RNA,所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分 离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。一、试剂准备1. 溶液I: 50mM 葡萄

3、糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0), 10mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl(pH 8.0) 12.5ml, 0.5M EDTA (pH 8.0) 10ml，葡萄糖 4.730g，加 ddH2O 至 500ml。在 10 lbf/in2 高压灭菌 15min，贮存于 4C。2. 溶液II： 0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加 ddO 至 10ml。使用前临 时配置。3. 溶液III：醋酸钾(KAc)缓冲液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加 ddH2O 至 500ml。4 C保存备用。

4、4. TE： 10mM Tris-HCl(pH 8.0)， 1mM EDTA(pH 8.0)。 1M Tris-HCl (pH 8.0) 1ml， 0.5M EDTA (pH 8.0) 0.2ml，加 ddH2O 至 100ml。15 lbf/in2 高压湿热灭菌 20min，4C保存备用。5. 苯酚/氯仿/异戊醇(25： 24： 1)6. 乙醇(无水乙醇、 70%乙醇)7. 5 XTBE： Tris 碱 54g，硼酸 27.5g, EDTA-Na? 2H2O 4.65g，力口 ddH2O 至 1000ml。15 lbf/in2 高压湿热灭菌20min, 4C保存备用。8 溴化乙锭(EB)：

5、10mg/ml9.RNase A(RNA 酶 A)：不含 DNA 酶(DNase-free) RNase A 的 10mg/ml,TE 配制，沸水加热 15min, 分装后贮存于-20 Co10.6 Xloading buffer (上样缓冲液)：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF, 40% (W/V)蔗糖水溶 液。11. 1%琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖于三角烧瓶中，加100ml 0.5 XTBE,微波炉加热至完全溶化, 冷却至60C左右，加EB母液(10mg/ml)至终浓度0.5p g/ml (注意：EB为强诱变剂，操作时 带手套)，轻轻摇匀。缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，

6、静置冷却30min以上，轻 轻拔出梳子，放入电泳槽中(电泳缓冲液0.5XTBE),即可上样。二、操作步骤1.挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0ml LB (含相应抗生素)液体培养基中，37C、 250g 振荡培养过夜(约 12-14hr)。2取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心8000gX1min,弃上清，将离心管倒置，使液体尽 可能流尽。3将细菌沉淀重悬于100p l预冷的溶液I中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。4加200p l新鲜配制的溶液II,颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2-3min, 使细胞膜裂解（溶液II为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。5加入1

7、50p l预冷的溶液III,将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3-5min。 溶液III为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同 时K+吏SDS-蛋白复合物沉淀。6加入450p l的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，4C离心12000g X lOmin。7小心移出上清于一新微量离心管中，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2-5min， 4C离心 12OOOgX15min。8.1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1-2次，4C离心8000gX7min,弃上清，将沉淀在室温下晾干。 9沉淀溶于20p l TE （含RNase A 20p g/

8、ml）, 37C水浴30min以降解RNA分子，-20C保存备 用。三、质粒 DNA 的电泳检测观察琼脂凝胶中 DNA 的最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。该物质含有一个可 以嵌入 DNA 的堆积碱基之间的一个平面基团，这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导 致染料与 DNA 结合并呈现荧光，其荧光产率比游离染料溶液有所增加。 DNA 吸收 254nm 处的 紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身则在302nm和366nm有光吸收。这两种情况下， 被吸收的能量可在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。因此，当凝胶中含有游离溴化乙 锭时即可以检测到少量的 DNA。取制备的质粒DNA 1-2p l，加适当loading buffer混匀上样，采用1-5V/cm的电压，使DNA分 子从负极向正极移动至合适位置，取出凝胶置紫外灯下检测，摄片。四、注意事项本裂解法小量制备质粒 DNA 重复性好，一般无麻烦。若所提取质粒 DNA 不能被限制性内 切酶切割，可通过酚/氯仿再次抽提，以清除杂质来解决问题。