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1、生化试验指导实验一：蛋白质及氨基酸的呈色反应目的：1. 了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。2. 了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。3. 学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。（一）双缩脲反应实验原理尿素加热至180C左右生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环 境中能与cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白 质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。可用于蛋 白质的定性或定量测定。 一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应 的物质不一定都是蛋白质或多肽。实验器材及试剂器材： 试管、酒精灯、试管夹、试管架试剂：（1）尿素（2）10%氢氧
2、化钠溶液（3）1%硫酸铜溶液（4）2卵清蛋白溶液实验步骤1. 取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素 开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后，加 10氢氧化钠溶 液约 1 毫升，振荡混匀，再加 1硫酸铜溶液 1 滴，再振荡。观察出现的粉红颜 色。避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。2. 向另一试管加卵清蛋白溶液约 l 毫升和 10氢氧化钠溶液约 2 毫升，摇匀， 再加 1硫酸铜溶液 2 滴，随加随摇，观察紫玫色的出现。（二）茚三酮反应 实验原理 除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有a 氨 基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应
3、生成蓝紫色物质。 该反应十分灵敏， 1：1 500 000 浓度的氨基酸水溶液即能给出反 应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。 茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成 CO2、 NH3 和 醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮 同另一个水合茚三酮分于和氨缩合生成有色物质。实验器材及试剂器材： 试管、酒精灯、试管夹、试管架试剂：（1）蛋白质溶液：2%卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液（蛋清：水=1： 9）(2) 0.5甘氨酸溶液(3)0.1茚三酮水溶液 (4)0.1茚三酮乙醇溶液 实验步骤(1) 取 2 支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液 1 毫升，再各加 0.5 毫升
4、 0.1茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热12 分钟，观察颜色由粉色变紫红 色再变蓝。(2) 在一小块滤纸上滴一滴 0.5的甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴上一 滴 0.1 的茚三酮乙醇溶液在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。(三) 黄色反应实验原理 含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸遇硝酸后，可被硝化成黄 色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。反应 式如下： 实验器材及试剂 器材： 试管、酒精灯、试管夹、试管架 试剂：(1) 鸡蛋清溶液 将新鲜鸡蛋的蛋清与水按 1：20 混匀，然后用六层 纱布过滤。(2) 大豆提取液 将大豆浸泡充分吸胀后研磨成浆状用纱布过滤。(3)
5、头发 (4)指甲(5)0.5苯酚溶液(6)浓硝酸 (7)0.3色氨酸溶液 (8)0.3酪氨酸溶液 (9)10氢氧化钠溶液 实验步骤向 7 个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应 慢可略放置或用微火加热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入 10 氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。(四) 考马斯亮蓝反应实验原理 考马斯亮蓝 G250 具有红色和蓝色两种色调。在酸性溶液中，其以游 离态存在，呈棕红色；在偏中性溶液中呈蓝黑色；当它与蛋白质通过疏水 作用结合后变为蓝色。在 0.011.0mg 蛋白质范围内，蛋白质浓度与 A595nm 值成正 比。常用来测定蛋白质含量。实验器材及试剂
6、器材： 试管、移液管、试管架 试剂：(1) 考马斯亮蓝染液(2) 蛋白质样品实验步骤按国下表进行操作商1 管号蛋白质沼瘦 (ml)蒸偶水CmL)考马斷蛊蓝CnL1012.520_10.92.5思考题1. 通过本次试验，你掌握了几种鉴定蛋白质和氨基酸的方法？它们的 原理？2. 从本次实验的每个实验中，应该注意的事项都有哪些？实验二 蛋白质的等电点测定和沉淀反应 一、蛋白质等电点的测定实验目的(1) 了解蛋白质的两性解离性质。(2) 学习测定蛋白质等电点的一种方法。实验原理蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下列平衡蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的pH达到一 定数值时，
7、蛋白质颗粒上正负电荷的数日相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移 动，也不向阳极移动，此时溶液的 pH 值称为此种蛋白质的等电点。不同蛋白质 各有其特异的等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性 质的变化测定各种蛋白质的等电点。最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液 pH 值。本实验借观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。用醋酸与酷 酸钠(醋酸钠混合在酪蛋白溶液中)配制成各种不同 pH 值的缓冲液。向诸缓冲溶 液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的 pH 值即为酪蛋白的等电点。实验器材及试剂器材：水浴锅、温度计、200毫升锥形瓶、100 毫升容量瓶、吸管、试管、试管架
8、、 乳钵 试剂：(1) 0.4酪蛋白醋酸钠溶液(2) 1.00 摩尔升醋酸溶液(3) 0.10 摩尔升醋酸溶液(4) 0.01 摩尔升醋酸溶液实验步骤(1) 取同样规格的试营 4 支，按下表颠序分别精确地加入各试剂，然后混匀。(2) 向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液 1 毫升，加一管，摇句一管。此时 1、2、3、4管的pH值依次为5.9、5.3、4.7、3.5。观察其混浊度。静置10分钟后， 再观察其混浊度。最混浊的一管的 pH 即为酪蛋白的等电点。二、蛋白质的沉淀及变性实验目的(1) 加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。(2) 了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。(3) 了解蛋白质变性与
9、沉淀的关系实验原理 在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶 体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颖拉可因失去电荷和脱水而沉淀。 蛋白质的沉淀反应可分为两类。 (1) 可逆的沉淀反应； (2)不可逆沉淀反应；实验器材及试剂试剂：(1)蛋白质溶液(2) pH4.7 醋酸醋酸钠的缓冲溶液(3) 3%硝酸银溶液(4) 5三氯乙酸溶液(5) 95乙醇(6) 饱和硫酸铵溶液7)硫酸铵结晶粉末(8)0.1mol/L 盐酸溶液(9) 0.1mol/L 氢氧化钠溶液(10) 0.05 碳酸钠溶液(11) 0.1mol/L 醋酸溶液(12)甲基红溶液实验步骤(1)蛋白质的盐析。无机盐
10、(硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等 )浓溶液能析出蛋白质。盐的 浓度不同，析出的蛋白质也不同。如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸 铵溶液中才能析出。加 5卵靖蛋白溶液 5 毫升于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静 置数分钟则析出球蛋白的沉淀。倒出少量混蚀沉淀，加少量水，是否溶解，为什 么？(2)重金属离子沉淀蛋白质 重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。取一支试管，加入蛋白质溶液2毫升，再加3%硝酸银溶液12滴，振荡试管，有沉淀产生。放置片刻，倾出 上消液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什么？（3）某些有机酸沉淀蛋白质取一支试管，加入蛋白质溶液 2 毫升，再加
11、入 1 毫升 5三氯乙酸溶液，振荡 试管，观察沉淀的生成。放置片刻，倾出上清液，向沉淀中加入少量水，观察沉 淀是否溶解。（4）有机溶剂沉淀蛋白质 取一支试管，加入2 毫升蛋白质溶液，再加入2 毫升 95乙醇。混匀，观察沉 淀的生成。思考题1. 通过本实验你掌握了几种鉴定蛋白质和氨基酸的方法 ?它们的原 理?2. 测定pl有什么意义？ pl是固定常数的吗？3. 解释下列名词：水化层；双电层；蛋白质变性；盐溶与盐析；蛋白 质等电点沉淀。4. 根据实验现象，讨论下列问题：1）蛋白质可逆沉淀与不可逆沉淀的本质区别是什么？2）简述蛋白质的沉淀反应、变性作用和凝固作用的相互关系。 实验四氨基酸的分离鉴定纸
12、层析法实验目的1. 通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法2. 掌握氨基酸纸上层层析法的操作技术（点样、平衡、展层、显色、 鉴定）实验原理纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。 层析溶剂由有机溶剂和水组成。物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用 Rf 值（比移）来表示的：Rf = 原点到层析中心的距离 / 原点到溶剂前沿的距离 在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的 结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本 实验利用纸层析法分离氨基酸。实验器材及试剂器材：层析缸、毛细管、喷雾器、培养皿、层析滤纸试剂：1. 扩展剂 是 4 份水饱和的正丁醇
13、和1 份醋酸的混合物。将 20mL 正丁醇 和 5mL 冰醋酸放人分液漏斗中，与 15mL 水混合，充分振荡，静置后分层， 放出下层水层。取漏斗内的扩展剂约 5mL 置于小烧杯中做平衡溶剂，其 余的倒人培养皿中备用。2. 氨基酸溶液 0.5的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液 及它们的混合液（各组份浓度均为 05）。3.显色剂：50IOOmLO.1%水合茚三酮正丁醇溶液。实验步骤1. 将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。2. 取层析滤纸（长22 cm、宽14 cm）张。在纸的一端距边缘23 cm处用铅 笔划一直线，在此直线上每间隔 2cm 作一记号。3. 点样用毛细管将各氨基酸
14、样品分别点在这 6个位置上，干后再点一次。每 点在纸上扩散的直径，最大不超过 3mm。4. 扩展 将滤纸折成W状，纸的两边不能接触。将盛有约20 mL扩展剂的培 养皿，迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中 （点样的一端在下， 扩展剂的液面需低于点样线1cm）。待溶剂上升15 20 cm时即取出滤纸，铅笔 描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。5. 显色 用喷雾器均匀喷上 0。 1茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤 5 分钟（100 C）或用热风吹干即可显出各层析斑点。6. 计算各种氨基酸的 Rf 值。思考题1. 何谓纸层析法?2. 2.何谓及f值?影响只f值的主要因素是什么？
15、3. 3.怎样制备扩展剂?实验五 酪蛋白的制备实验目的1. 学习从牛奶中制备酪蛋白的原理和方法。2. 掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法。实验原理牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋 白质的混合物，等电点为 4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳 的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂 质后便可得到纯酪蛋白。 实验器材及试剂器材： 离心机、抽滤装置、精密 pH 试纸或酸度计、电炉、温度计 试剂：1. 新鲜牛奶2.95%乙醇3. 无水乙醚4.0.2mol/L pH4.7醋酸一一醋酸钠缓冲液5.乙醇一一乙醚混合液：乙醇：乙醚=1 : 1（V/V） 实验步骤一）酪蛋白的粗提100mL牛奶加热至40C。在搅拌下慢慢加入预热至40C、pH4.7的醋酸缓冲液 100mL，用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。将上述悬浮液冷却至室温。离心15分
