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1、8. 大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化大肠杆菌表达系统遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点，是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。因此熟练掌握并运用大肠杆菌表达系统的基本原理和常规操作是对每一个研究生来说是非常必要的。本章节介绍了实验室常用的大肠杆菌表达系统的构成特点，归纳了利用大肠杆菌表达系统纯化重组蛋白的基本流程和详细操作步骤，并且结合笔者的操作经验，总结了初学者在操作过程中可能遇到的问题和解决策略。8.1 大肠杆菌表达系统的选择与构建表达载体的选择根据启动子的不同这些载体大致可以分为热诱导启动子，如PL，cspA 等和另外一类就是广泛使用的IPT
2、G诱导的启动子，如 lac ，trc ，tac ，T5/lac operator， T5/lac operator等。根据表达蛋白质的类型可分为单纯表达载体和融合表达载体。融合表达是在目标蛋白的N端或 C端添加特殊的序列，以提高蛋白的可溶性，促进蛋白的正确折叠，实现目的蛋白的快速亲和纯化，或者实现目标蛋白的表达定位。常用的用于亲和纯化融合标签包括Poly-Arg ，Poly-His, Strep-Tag n,S-tag，MBPHis-Tag和GST-Tag是目前使用最多的。His等。其中Tag 大多数是连续的六个 His 融合于目标蛋白的 N 端或 C端，通过 His 与金属离子：Cu2+Fe
3、2+Zn2+Ni2+的螯合作用而实现亲和纯化，其中Ni2+是目前使用最广泛的。 His 标签具有较小的分子量，融合于目标蛋白的N 端和 C端不影响目标蛋白的活性，因此纯化过程中大多不需要去除。目前常使用的表达载体主要是由 Novagen 提供的 pET 系列和 Qiagen 公司提供的 pQE系列。除了 His 标签外，还原性谷胱甘肽S-转移酶是另一种实验室常用的融合标签。它可以通过还原性谷胱甘肽琼脂糖亲和层析而快速纯化。此外，与His 相比， GST 很多时候能够促进目标蛋白的正确折叠，提高目标蛋白表达的可溶性，因此，对于那些用 his 标签表达易形成包涵体的蛋白，可以尝试用GST融合表达来
4、改进。当然，GST 具有较大的分子量（26kDa），可能对目的蛋白的活性有影响，因此很多时候切除GST是必须的。目前， GST融合表达系统主要是由GE Healthcare（原 Amersham）提供。宿主菌的选择重组质粒的构建一般选择遗传稳定，转化效率高，质粒产量高的菌株作为受体菌，常用的有E.coli DH5a, E.coli JM109E.coli DH 10B，E.coli NovaBl pe等recA 1和end A园细胞。作为表达宿主菌必须具备几个基，本特点：遗传稳定，生长速度快，表达蛋白稳定。具体操作过程中，根据所使用的表达载体的特点，目的基因密码子的组成等选择特定的表达宿主菌。
5、以下是实验室常用的几种表达宿主：BL2:Ion和ompT蛋白酶缺陷型，避免了宿主对外源蛋白的降解。是经典的使用最广泛的表达受体。适用于Tac，Trc ， Lac，入 PL， cspA 等作为启动子的载体。BL21 （ DE3） : DE3噬菌体溶源于 BL21形成的带有染色体 T7 RNA 聚合酶基因大肠杆菌。 IPTG诱 导的 lac MV5 启动子控制 T7 RNA聚合酶基因表达 T7 RNA聚合酶，进而控制 T7 表达系统表达目的蛋白。BL21（DE3T7表达系统BL21（DE3Novagen公司开发了一些特殊的表达宿主细胞。）衍生系列：在经典的）的基础上，比如：Origami（DE3O
6、rigami B（DE3Rosetta-gami（DE3trxB和gor双突变。拥），）和）菌株带有有 trxB 和 gor 突变的菌株比单具， trxB 突变的菌株更有可能促进二硫键的形成，使蛋白可溶性更好，活性更高。Rosetta ?系列：是经过修饰，专用于带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白表达的菌株。经提高稀有tRNA 水平，可以提高一些真核基因表达效率（更多信息可参考相应公司的资料）。BL21-Codon Plus系列：包括BL21-CodonPlus（DE3 -RIPL，BL21-CodonPIp）s?-RIL ，BL21-CodonPI吧？（DE3 -RIL, BL21-CodonP
7、l吧？-RP BL21- CodonPlus），（ DE3） -RP 等。这些受体菌添加了大肠杆菌中编码精氨酸（R），亮氨酸（ L），异亮氨酸（ I ）和脯氨酸（ P）稀有密码子的 tRNA基因，更多用于表达一些真核生物的基因。其中RIL 系列常用于 AT含量高的基因，而 RP系列主要用于 GC含量高的基因（更多信息参考Stratagene公司资料）M15/SG13009: 自身表达 T5 RNA polymerase ，主要用于 pQE系列载体的表达。另一个需要考虑的是大肠杆菌的密码子及其偏爱性。表 1 大肠杆菌密码子使用频率统计FRFRTAAFRQCAAAAAGAAQQTCTGTTTF19
8、.7STATYCT5.716.8TTCTGTTCF15STACYCC5.514.6CTTCTGTTAL15.2STAAstopstopA7.81.8ATCTGTTGL11.9STAGstopWG80GCCCGCTTLP8.4CATHR12T15.8TCCCCGCTCLPCACHR11C6.413.1CFRQ5.98110.721.126CCCGCTALAPCAAQR5.36.612.1A4.3CTLCCPCAQCGRG46.9G26.7G27.7G4.1ACAGATTITAATN30.5T821.9TS7.2ACAGATCITAACNS30.6C22.824.4C16.6AACAGATAITA
9、AAKR30.7A6.433.2A1.4ACAGATGMTAAGKR30.8G11.512.1G1.6GCGGTTVAGATDG16.8T10.737.9GT21.3GTVGCAGADGGC16.9C31.6C20.5GC33.4GGCGGTAVAGAAEG9.216.1A21.143.7GAGGT16.1GCGAAEGG8.6VG1G38.5G18.4G8.2 表达条件的建立为了方便后续的纯化操作, 保持目标蛋白的活性 ，提高蛋白的得率，我们在进行蛋白的大量制备之前应该首先确定目标蛋白的最佳表达条件。首先，保证表达蛋白稳定，尽量避免蛋白酶的降解，我们可以通过使用一些蛋白酶缺陷性的表达宿主，其次在表达的过程中可以在培养体系中添加一些蛋白酶抑制剂等来解决。与实现外源蛋白的稳定表达相比，更多时候保证目标蛋白的可溶性表达，是建立表达条件的主要工作。很多外源基因在大肠
