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1、分子标记技术和应用一、基于DNA杂交技术的分子标记RFLP（RestrictionFragmentLengthPolymorphism,DNA限制片段长度多态性）RFLP是以Southern杂交为核心,应用最早的分子标记技术。RFLP首先是在人类基因组争论中进展起来的,主要用于遗传疾病诊断和法医鉴定，RFLP的概念由人类遗传学家Botstein等首次提出，其原理为:碱基的转变与染色体结构的变化导致生物个体或种群之间DNA片段酶切位点的变化，用限制性内切酶切割转变的DNA，将产生长短、种类、数目不同的限制性片段,这些片段经聚丙烯酰胺凝胶电泳分别后就会呈现出不同的带状分布,而具有差异的DNA片段就
2、可通过Southern杂交检测出来。接受RFLP技术可进行遗传图谱构建、基因定位、数量性状基因座定位（QTL）及遗传多态性分析等。RFLP标记具有下列优点：结果牢靠，这是由于限制性内切核酸酶识别序列的专一性准备的。结果稳定，RFLP标记无表型效应，其检测不受外界条件、性别及发育阶段的影响。RFLP标记的等位基因间是共显性的，对选择隐形基因极为有利。RFLP标记的非等位基因之间不存在基因互作，标记互不干扰。RFLP起源于基因组DNA的自然变异，这些变异在数量上几乎不受限制，而且可接受的探针许多，可以检测到许多遗传位点。但RFLP标记也有自身的不足：需要大量高纯度的DNA（5-10“g）。所需仪器
3、设施较多、检测步骤多、技术较简洁，周期长、成本高。通常都用到同位素，对人体有确定的损害。具有种属特异性，且只适合单拷贝和低拷贝基因。多态性产生的基础是限制性酶切位点的丢失或获得，所以RFLP多态位点数仅1或2个，多态信息含量低。二、基于PCR技术的分子标记技术1基于随机引物PCR的分子标记技术在聚合酶链式反应（PCR）技术制造后（1987年，Mullis和Faloona）,由于PCR技术操作简洁，成功率较高，消逝了一大批以PCR技术为基础的分子标记。11RAPD（RandomAmplifiedPolymorphicDNA,DNA随机扩增多态性）聚合酶链式反应（PolymeraseChainRe
4、action,PCR）的消逝，使得生物体外模拟DNA合成成为可能。以DNA为模板，接受设计好的引物进行扩增。短时间内即可对扩增结果进行检测。但扩增前需知道模板DNA片段序列的一些信息,然后依据模板信息设计合成引物,再通过PCR反应选择性地扩增DNA片段，这在确定程度上制约了DNA指纹技术的使用和进展。1990年美国的Willianms和Welsh分别提出了一种建立在PCR基础上的DNA分子标记技术DNA随机扩增多态性（RandomAmplifiedPolymorphicDNA,RAPD）接受该技术可在对物种没有任何分子生物学基础信息的状况下对其进行DNA多态性分析。其原理是接受一系列人工合成、
5、碱基随机排列的寡核苷酸单链为引物（常用10bp核苷酸），通过PCR技术对所争论的基因组片段进行扩增，便可得到1条扩增产物。一般植物基因组每个引物可扩增出210个DNA片段，每个扩增片段代表了基因组上的1个位点。扩增产物经琼脂糖电泳分别、EB染色后即可检测;也可对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后用银染法显示;此外，为提高检测灵敏度，也可对扩增产物进行同位素标记，再用PAGE分别，用放射自显影检测，扩增产物的多态性基本反映了基因组DNA的多态性。与RFLP标记相比，RAPD标记具有以下优点：所需模板DNA量少，且对DNA的质量要求不高。分析程序较简洁，不涉及放射性同位素，一般试验室即可进行。不
6、需了解目的基因的DNA序列，不需设计特地的引物，引物在不同物种间具有通用性。引物合成商品化，成本低。可用引物数量多，掩盖整个基因组，多态性检出率高oRAPD标记已广泛应用于园艺植物的种质资源鉴定分类、目标性状基因的分子标记、遗传谱图的构建、品种纯度鉴定等争论。RAPD也有确定的限制性：退火温度较低，PCR反应受环境条件影响较大，检测结果稳定性、重复性差。大部分RAPD标记表现显性，不能区分杂合与纯合基因型，不能供应完整的遗传信息。存在共迁移问题，同一条带中可能含有长度相同而序列不同的片段。1.2STS（SquenceTaggedSites,STS）该标记是由Olsen等（1989）提出，通常接
7、受的方法是将与目的性状基因连锁的RFLP标记的两端测序，并依据测序结果分别合成20bp左右的特异引物，通过PCR扩增产生一段200-500bp的特异序列，且核苷酸序列已知的单拷贝序列。STS引物的获得主要来自RFLP标记单拷贝的探针序列，微卫星序列，Alu因子；表达基因序列及人造酵母染色体（YAC）或粘粒的插入末端序列。该标记的特点：表现为共显性标记，很简洁在不同组合间进行标记的转移，是沟通植物遗传图谱和物理图谱的中介。尽管STS直接检测到的DNA多态性效率低，但可将其在PCR扩展产物经限制性酶切后进行变性电泳方法提高检测效率。随着技术进展，STS可检测到半个碱基之间差异，使其在基因组争论中发
8、挥的作用更大。13AFLP（Amplifiedfragmentlengthpolymorphism扩增片段长度多态性）AFLP扩增片段长度多态性，1992年荷兰科学家ZabeauMare和VosPieter建立起了AFLP技术。接受2种或2种以上的限制性内切酶对DNA进行酶切，形成不同酶切位点的限制性片段，在酶切片段上加上双链人工接头作为PCR扩增模板,AFLP技术可将引物与酶切片段识别序列接合起来，其引物从53依次为核心序列、酶切识别序列、3端选择碱基序列。核心序列与人工接头互补,3端选择碱基种类、数目、挨次准备了PCR的特殊性，以达到专一PCR,从而实现酶切片段被选择性扩增。AFLP指纹呈
9、孟德尔式共显性和显隐性遗传，是一种高效指纹技术，是在RAPD和RFLP技术基础上建立和进展起来的，兼具RAPD与RFLP的优点。AFLP分析不受环境、季节、时间的限制，所需DNA量较少，灵敏高效，多态性高，用少量的选择性引物就可获得大量的多态性片段，且重复性好，结果牢靠，适合大规模样品的研究。AFLP标记的主要不足包括：对基因组DNA和限制酶的质量要求高，酶切不完全可能会消逝假阳性；操作步骤较多，对试验技能要求较高，成本也较高；大多数为显性标记，并且很难鉴别等位基因；该技术已申请专利，只能用于非盈利的科学争论。2基于DNA芯片技术的分子标记21SNP（SingleNucleotidePolym
10、orphisms单核苷酸多态性）单核苷酸多态性（SingleNucleotidePolymorphisms，SNPs）是指同一位点的不同等位基因之间只有一个核苷酸的差异或只有小的插入、缺失。SNPs是一种双等位基因形成的多态，而微卫星则是多等位基因形式的多态。在基因组中，SNPs的数量远远多于微卫星多态，SNPs是继第1代分子标记RFLP，第2代分子标记微卫星后的第3代分子标记。但是SNPs是建立在基因组大量测序或者基因芯片的基础上的，争论成本高，技术要求高。2.2SSR（Simplesequencerepeats,简洁重复序列）简洁重复序列也称为微卫星DNA（Microsatellite），
11、由Litt等创建。SSR序列是以16个碱基为重复单元的串联重复序列，广泛分布于真核生物基因组的编码区和非编码区。SSR是目前较优秀的遗传标记技术之一，尤其适用于生物群体内的遗传多样性争论。SSR目前主要用于遗传多样性分析、基因定位、DNA指纹和品种鉴定、种质资源保存和标记关心育种等方面。SSR标记一般依据孟德尔方式进行分别，呈共显性遗传,所显示的带型较简洁，纪录的条带全都、客观、明确;接受PCR技术检测时只需少量的DNA样品，且对DNA的质量要求不高,对长期保存及有部分降解的样品均可进行分析。同时,SSR还具有多态性高、试验程序简单、特异性强等优点。在真核生物基因组中散布着大量的小卫星和微卫星
12、，小卫星由串联重复的短序列（核心序列）组成，重复单位的长度一般为十几个到几十bp;微卫星则是由更短的重复单位串联而成，重复单位一般为26bp。许多小卫星和微卫星位点的重复单位拷贝,可能与有丝分裂过程中同源小卫星和微卫星间的不等交换或复制过程中DNA滑动的高度可变有关。通常接受聚丙烯酰胺凝胶电泳17、银染检测PCR产物。获得基因组SSR标记一般都需建立和筛选基因组文库、克隆、测序等一系列操作。因此消耗人力、物力,成本较高,这限制了SSR技术的应用。近年来，随着公共数据库的进展,一种新开发的SSR分子标记方法EST-SSR已成为争论热点，这种接受公共数据库中EST序列开发的SSR标记具有成本低、方
13、法简便等特点。Zietkiewicz等在SSR技术的基础上创建了ISSR（Inter-smipieSequenceRepeats）标记。该技术以加锚SSR（SmipleSequenceRepeat）寡核苷酸为引物，对2个相距较近、方向相反的SSR序列间的一段短DNA片段进行扩增，具有引物设计简洁、不需提前知道DNA序列、呈显性或共显性遗传等特点。新兴的分子标记技术1.RGAS（ResistanceGeneAnalogsPolymorphism,抗病基因类似物标记）RGAS分子标记技术是用抗病基因的保守序列设计引物扩增基因组得到的抗病类似序列，是一种新型的分子标记。比较已克隆的抗病基因序列，多数
14、抗病基因具有核苷酸结合位点（NBS），亮氨酸富集重复序列区（LRR）、丝氨酸/苏氨酸激酶（STK）、跨膜结构域（TM）、亮氨酸拉链结构域（LZ）和果蝇蛋白Toll和人类白细胞介素-1受体类似结构域（TIR）等保守序列，这些保守序列区域参与蛋白质间的相互作用。尽管RGAS核苷酸同源序列很低，然而抗病基因保守区还是为克隆抗病基因供应了可能。2SRAP（Sequence-RelatedAmplifiedPolymorphism相关序列扩增多态性）SRAP标记是Li等进展的一种新型的基于PCR的分子标记技术。SRAP标记的原理是接受植物外显子里G/C含量丰富而启动子和内含子里A/T含量丰富的特点。该标
15、记通过独特的引物设计对ORFs（OpenReadingFrames）进行扩增，上游引物长17bp，5端前10个碱基为“填充”序列（FillerSequence），无任何特异组成,接着为CCGG序列，该序列组成核心序列及3端3个选择性碱基，可对外显子进行特异性扩增;下游引物长18bp，5端前11个碱基为“填充”序列，紧接着是AATT该序列组成核心序列及3端3个选择性碱基，可对内含子区域、启动子区域进行特异性扩增，扩增因个体不同以及物种的内含子、启动子与间隔区长度不等而产生多态性。该标记多态性高、重复性好、操作简洁，在基因中分布均匀；引物具有通用性，而且用少量正向引物和反向引物可组合成多个引物对，
16、提高了引物的使用效率，降低引物合成成本；共显性标记的频率较高，约占总标记的20%；目的标记比较简洁分别并测序；主要检测基因组的ORF，提高了扩增结果与植物表型的相关性，能更多地反映材料表型差异。不足之处在于对ORF较少的着丝粒四周以及端粒的扩增会较少，可能会使所构建的连锁图谱缩短或消逝连锁群断开的现象。3.TRAP（TargetRegionAmplifiedPolymorphism靶位区域扩增多态性）靶位区域扩增多态性（TargetRegionAmplifiedPolymor-phism，TRAP）是一种新型的基于PCR的分子标记，由Hu等于2003年提出。TRAP技术具有简洁、高效、重复性好、共显性和易测序等优点。且可检测基因的可译框（ORFs）区域。TRAP的原理是接受生物信息工具和表达序列标签数据库信息，产生目标候选基因区多态性标记。与SRAP、AFLP等标记不同,TRAP技术是基于已知的cDNA或EST序列信息建立起来的。目前,已获得许多物种的基因组序
