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1、阿帕替尼对肺癌细胞侵袭迁移的影响及其作用机制袁茵;陈军;宫颢;李永文;张洪兵;李颖;李伟婷;王攀;施睿峰;刘红雨【摘要】背景与目的 肺癌是世界上对人类健康产生重大危害的癌症之一,近年来靶 向治疗的效果日益显著阿帕替尼(Apatinib,YN968D1)是目前研究较热的多靶点抗 肿瘤药物，本研究旨在探讨Apatinib对肺癌细胞生物学特性的影响和其可能的作用 机制.方法体外培养肺腺癌细胞株H1299与H3255,CCK法、划痕实验及Transwell实验检测Apatinib对H1299与H3255细胞增殖、迁移及侵袭的影 响,Western blot检测肿瘤血管生成和侵袭相关蛋白的表达结果Apa
2、tinib显著抑 制H1299与H3255的增殖、迁移及侵袭能力，并呈浓度依赖性.Western blot显 示，随药物浓度增加,VEGF、VEGFR2、N-cadherin、MMP9、MMP2、Vimentin 表达下调,E-cadherin表达上调结论Apatinib可抑制肺腺癌细胞H1299、H3255 的侵袭迁移能力,其机制可能通过调控上皮-间充质转化及基质金属蛋白酶相关蛋白 的表达来实现.【期刊名称】中国肺癌杂志【年(卷),期】2019(022)005【总页数】7页(P264-270) 【关键词】 阿帕替尼;肺肿瘤;侵袭;迁移【作 者】 袁茵;陈军;宫颢;李永文;张洪兵;李颖;李伟婷
3、;王攀;施睿峰;刘红雨【作者单位】 300052 天津,天津医科大学总医院肺部肿瘤外科;300052 天津,天津 医科大学总医院肺部肿瘤外科;300052 天津,天津医科大学总医院天津市肺癌研究 所,天津市肺癌转移与肿瘤微环境重点实验室;300052 天津,天津医科大学总医院肺 部肿瘤外科;300052 天津,天津医科大学总医院天津市肺癌研究所,天津市肺癌转移 与肿瘤微环境重点实验室;300052 天津,天津医科大学总医院肺部肿瘤外 科;300052 天津,天津医科大学总医院天津市肺癌研究所,天津市肺癌转移与肿瘤微 环境重点实验室;300052天津,天津医科大学总医院肺部肿瘤外科;300052
4、 天津,天 津医科大学总医院肺部肿瘤外科;300052 天津,天津医科大学总医院肺部肿瘤外 科;300052 天津,天津医科大学总医院天津市肺癌研究所,天津市肺癌转移与肿瘤微 环境重点实验室【正文语种】中 文肺癌是目前世界上最重要和致命的癌症之一，其死亡病例占所有癌症死亡人数的25%。在所有肺癌病例中，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC ） 占80%-85%。NSCLC包括腺癌、鳞癌和大细胞肺癌三种主要的组织类型，其中 腺癌约占40%-50%，鳞癌约占20%-30%1-3。只有少部分NSCLC患者在早期（I期或II期）诊断；超过60%的肺癌患者在诊
5、断时肿瘤已出现侵袭或转移性病变 （III期或IV期）2。在过去的20年里，尽管肺癌的诊断和治疗技术得到了较大 的进步，但肺癌的5年生存率仍然在10%-17%之间。其原因在于，多数的患者发 生了转移。约30%的患者在初诊时就有远处转移， 50%-60%的患者在治疗过程中 发生转移，80%-90%的患者最终死于转移，因此，转移是肺癌患者最严重的挑战， 是肺癌患者死亡的最重要原因4。肿瘤的血管生成（angiogenesis ）是肿瘤发展中的一个重要过程。肿瘤的生长有两个明显不同的阶段，即从无血管的缓慢生长阶段转变为有血管的快速增殖阶段， 血管生成使肿瘤能够获得足够的营养物质，并且促进肿瘤的侵袭转移，
6、是肿瘤生长 和发展的关键环节。其中，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF )可刺激内皮细胞增殖与分化，是胚胎发生、骨骼生长期间生理性血 管生成的关键调节因子。在近年研究中，发现VEGF和血管内皮生长因子受体 (vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR)在肿瘤发生发展过程 中是促进肿瘤血管生成的重要因子，VEGF可通过VEGFR2正反馈作用刺激VEGF 产生，从而促进肿瘤血管生成，进而促进肿瘤的活性及转移，因此，针对 VEGF/VEGFR的治疗成为重要的肿瘤治疗方法之一。阿帕替
7、尼(Apatinib, YN968D1 )是一种新型多靶点抗肿瘤药物，其作为 VEGFR2酪氨酸激酶抑制剂，在体内及体外均有很高的活性，可通过抑制 VEGF/VEGFR2信号通路抑制血管生成6。最近研究7-12表明，Apatinib对 VEGFR2酪氨酸激酶抑制性治疗在胃癌、骨肉瘤、胆管癌、肝癌、结肠癌等多种肿 瘤中有效，其机制不仅抑制血管生成，还可能与抑制肿瘤细胞侵袭迁移作用有关， 其可能通过的途径为：通过STAT3抑制上皮-间充质转化(epithelial- mesenchymal transition, EMT );抑制 VEGFR2/RAF/MEK/ERK 及 PI3K/AKT/mT0
8、R通路；与KIF5B-RET在肿瘤中的驱动因素相关等。并且， Apatinib 可与表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR) 酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼(Geftininb )联用，在EGFR基因T790M突变的吉 非替尼耐药NSCLC细胞中，明显增强抗肿瘤作用13。上述研究表明，Apatinib 不但可以抑制血管生成进而抑制肿瘤的发生发展，还可通过多种途径抑制肿瘤的转 移。目前，我们对该药物在NSCLC中作用机制的了解仍然有限。本研究通过体外 实验探讨Apatinib对肺腺癌细胞侵袭迁移能力的影响，并进一步探索其潜在的下 游调控机制。1
9、材料与方法1.1细胞系及主要试剂人肺腺癌细胞系H1299( EGFR wt, N-Ras Q61K )与 H3255( EGFR L858R, K-Ras wt )购自中国科学院细胞库(中国上海)，阿帕替 尼(S7297 , Apatinib)购自 Selleck 公司，抗体：VEGF、VEGFR 2 抗体购自 Abeam 公司，MMP9、MMP2 抗体购自 Santa Cruz 公司，E-cadherin、N- cadherin、Vimentin、GAPDH 抗体购自 Cell Signaling Technology 公司。 RPMI-1640培养基、胎牛血清购自GIBCO公司。胰蛋白酶、
10、CCK-8均购自 Bioind公司。Tranwell购自美国Corning公司。二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO )购自碧云天公司。1.2细胞培养细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，置于37 C、 5%CO2饱和湿度的培养箱中，待细胞融合度达至90%左右，用0.25%胰酶- EDTA ( ethylenediaminetetracetic acid )消化传代，所有实验均采用对数生长 期细胞。1.3 CCK 8法测定细胞活性收集H1299与H3255呈对数期稳定生长的细胞，调 整细胞悬液浓度至2.5x104/mL,向96孔板中每孔加入200 pL
11、悬液，5%CO2 , 37 C培养过夜，待细胞贴壁后，各组加入浓度为0 pmol/L、2 pmol/L、4 pmol/L、8 pmol/L、16 pmol/L、32 pmol/L、64 pmol/L、128 pmol/L 梯度 递增的Apatinib 200 pL,每个浓度设4个复孔,5%CO2 37 C孵育24 h后，吸 去孔内培养基，每孔加入10 pL CCK-8及90 pL完全培养基，染色1 h;多功能 酶标仪以OD 450nm处测量各孔吸光值；计算细胞抑制率及IC50。1.4划痕实验将H1299与H3255细胞接种至6孔板中，加入完全培养基，待细 胞汇合率为85%-95%时，用200
12、pL黄色枪尖划痕，吸去孔内培养基，PBS洗3 次，将各孔分为对照组(NC)与不同浓度加药组，H1299细胞各组每孔分别加入 0 pmol/L、8 pmol/L、16 pmol/L Apatinib 2mL, H3255 细胞中各组每孔分另0 加入 0 pmol/L、4 pmol/L、8 pmol/L Apatinib 2 mL 于 0 h、12 h、24 h 时置 于倒置显微镜下观察拍照。细胞迁移率=100%x( 0 h划痕宽度-12 h或24 h划 痕宽度)/0 h划痕宽度。每个实验独立重复3次，取平均值。1.5侵袭实验准备Transwell及24孔板。按照1:10比例稀释基质胶并加入20
13、pL至Transwell小室上室，置于37 C温箱凝固4 h。收集加入完全培养基与加入 Apatinib 8 pmol/L培养24 h的H1299与H3255细胞，分为对照组(NC )与 加药组，使用无血清RPMI-1640培养基调整细胞浓度为1x105/mL,取200 pL 加入上室，将500 pL含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基加入下室，培养箱培 养 24 h 后取出小室，棉签轻柔擦去上室面细胞， 4%多聚甲醛固定，结晶紫染色， PBS 洗涤 3 遍。将小室置于倒置显微镜下观察，每个样本随机选取 5 个视野计数。 每个实验独立重复3次，取平均值。1.6蛋白质免疫印记实验将H129
14、9与H3255细胞接种至6孔板中，待细胞汇合 率为70%-80%时加入不同浓度Apatinib , 24 h后提取蛋白。BCA法测蛋白浓度。 加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，充分混匀,100 C金属浴变性15 min。每种 样品取30 pg蛋白上样电泳，采用湿转法电转移至PVDF膜，含5%脱脂牛奶的 TBST摇床上室温封闭2 h。将PVDF膜按照不同分子量切开，加入对应的抗体， 4 C摇床孵育过夜。次日用TBST室温漂洗3次，每次5 min ,加HRP标记的二 抗，室温孵育1 h，显色曝光，分析条带吸光值。1.7统计学分析应用SPSS 19.0版软件进行统计分析，GraphPad Pris
15、m 5.01版 软件处理数据分析作图，数据采用均数标准差表示，实验中组间比较采用两样本 均数t检验，以Pv 0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 Apatinib能抑制肺癌细胞H1299与H3255的活性如图1所示，在H1299 与H3255细胞中，经过不同浓度的Apatinib处理24 h后，Apatinib的IC50分 别为(32.673.12)pmol/L和(14.441.92)pmol/L,而且两个细胞的活性随 着Apatinib药物浓度的升高而呈明显下降趋势，提示Apatinib能够明显抑制肺 腺癌细胞H1299与H3255的活性。2.2 Apatinib能抑制肺癌细胞H129
16、9与H3255的迁移和侵袭能力为了研究 Apatinib对肺癌细胞H1299与H3255的迁移和侵袭能力的作用，我们分别用不 同浓度Apatinib处理H1299与H3255细胞，通过划痕实验分别在12 h和24 h 节点检测Apatinib对细胞迁移能力的影响。如图2A、图2C所示，在H1299细 胞中，与对照组(NC)相比,12 h时8 pmol/L Apatinib对细胞的迁移能力有一 定的抑制作用，但无统计学意义；而16 pmol/L Apatinib对细胞的迁移能力则有 明显的抑制作用(P v 0.05 ); 24 h时8 pmol/L与16 pmol/L Apatinib对细胞 的迁移能力均有明显的抑制作用，且药物高浓度抑制作用比低浓度更加明显(Pv 0.05 )。如图2B、图2D所示，在H3255细胞中，与对照组(NC)相比，12 h 与24 h时4 pmol/L与8 pmol/L Apatinib对细胞的迁移能力均有明显的
