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1、单克隆抗体的研制一、 单克隆抗体的概念 $ b3 A7c8 z； 9 kr，f 抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇,所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物.即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体,仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（olyclona ntibdy），简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使
2、用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现. 197年,Khle和Milst建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成细胞杂交瘤.这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系,它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体,即所谓单克隆抗体(onclonal antbod）,
3、简称单抗. 与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世,不仅带来了免疫学领域里的一次革命，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。 9 a9 7 z+ UKoler和Milstein两人由此杰出贡献而荣获194年度诺贝尔生理学和医学奖。二、杂交瘤技术 杂交瘤技术的诞生 / ：i： c IG。淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果,抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等,为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时,骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞
4、的筛选等提供了技术贮备。1975年月日,Kohlr和Milstein在英国自然杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”(ontiuou cltures o used cells secreng anibodyo predefine specfity)的著名论文.他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoaheguanosin phsphroyl taerse,HT)的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。融合由仙台病毒介导,杂交细胞通过在含有次黄嘌呤（ypanthie，H)、氨基喋呤(amnoterin,A）
5、和胸腺嘧啶核苷（thyidin，T)的培养基（T)中生长进行选择。在融合后的细胞群体里，尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是GPRT，但不能连续培养，只能在培养基中存活几天，而未融合的HGRT骨髓瘤细胞和相互融合的H-骨髓瘤细胞不能在AT培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本脾细胞的GPT和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性，而在HAT培养基中存活下来。实验的结果完全像起始设计的那样，最终得到了很多分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系。用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤,即所谓杂交瘤。生长杂交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体，即单克隆抗体. 4 *&H（
6、 q3 $ iz( w/？这一技术建立后不久，在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等方面即得到改进.最早仙台病毒被用做融合剂，后来发现聚乙二醇(E)的融合效果更好，且避免了病毒的污染问题,从而得到广泛的应用。随后建立的骨髓瘤细胞系如SP20-A14，X3g8.653和NS/1都是既不合成轻链又不合成重链的变种，所以由它们产生的杂交瘤细胞系，只分泌一种针对预定的抗原的抗体分子，克服了骨髓瘤细胞MOP21等的不足。再后来又建立了大鼠、人和鸡等用于细胞融合的骨髓瘤细胞系,但其基本原理和方法是一样的.2.2 基本程序和方法. 杂交瘤技术在具体操作上，各实验室使用的程序不尽一致。本节中介绍的方法是作者所在实验室
7、采用的、实践证明成熟的程序，该程序适合国内大多数实验室。 在开展杂交瘤技术制备单抗之前，培养骨髓瘤和杂交瘤细胞必须具备下列主要仪器设备:超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70)、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子,0min)、37水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等.其需要的主要器械包括:0m、50ml、2细胞培养瓶,1ml、1l刻度吸管，试管，滴管(弯头、直头），平皿,烧杯，0ml、2m、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10l、5ml、1ml注射器等,9孔、4孔细胞培养板，融合管（50l圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（50
8、u，200u,1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。此外，杂交瘤细胞的筛选与检测的仪器设备，依据检测单抗的方法不同而各异,请参阅本节有关部分。 淋巴细胞杂交瘤技术的主要步骤包括:动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、冻存、单抗的鉴定等.2.2。1抗原制备制备单克隆抗体的免疫抗原，从纯度上说虽不要求很高，但高纯度的抗原使得到所需单抗的机会增加，同时可以减轻筛选的工作量.因此，免疫抗原是越纯越好，应根据所研究的抗原和实验室的条件来决定。一般来说，抗原的来源有限，或性质不稳定，提纯时易变性，或其免疫原性很强，或所需单抗是用于抗原不同组分的纯化或分析等，
9、免疫用的抗原只需初步提纯甚至不提纯，但抗原中混杂物很多，特别是如果这些混杂物的免疫原性较强时，则必须对抗原进行纯化。检测用抗原可以是与免疫抗原纯度相同，也可是不同的纯度，这主要决定于所用筛检方法的种类及其特异性和敏感性。2.免疫动物的选择根据所用的骨髓瘤细胞可选用小鼠和大鼠作为免疫动物。因为，所有的供杂交瘤技术用的小鼠骨髓瘤细胞系均来源于A/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤细胞都来源于LOUc大鼠,所以一般的杂交瘤生产都是用这两种纯系动物作为免疫动物。但是,有时为了特殊目的而需进行种间杂交，则可免疫其他动物。种间杂交瘤一般分泌抗体的能力不稳定,因为染色体容易丢失。就小鼠而言,初次免疫时以812周龄为宜
10、，雌性鼠较便于操作。2.2。3免疫程序的确定 免疫是单抗制备过程中的重要环节之一，其目的在于使淋巴细胞在特异抗原刺激下分化、增殖,以利于细胞融合形成杂交细胞,并增加获得分泌特异性抗体的杂交瘤的机会.因此在设计免疫程序时，应考虑到抗原的性质和纯度、抗原量、免疫途径、免疫次数与间隔时间、佐剂的应用及动物对该抗原的应答能力等.没有一个免疫程序能适用于各种抗原.现用的免疫程序中多数是参照制备常规多克隆抗体的方法。表61列举了目前常用的免疫程序.免疫途径常用体内免疫法包括皮下注射、腹腔或静脉注射，也采用足垫、皮内、滴鼻或点眼.最后一次加强免疫多采用腹腔或静脉注射，目前尤其推崇后者,因为可使抗原对脾细胞作
11、用更迅速而充分。在最后一次加强免疫后第3天取脾融合为好，许多实验室的结果表明，初次免疫和再次免疫应答反应中，取脾细胞与骨髓瘤细胞 + I w3 s k融合,特异性杂交瘤的形成高峰分别为第4天和第22天，在初次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgM抗体，再次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌G抗体。笔者体会阳性杂交瘤出现的高峰与小鼠血清抗体的滴度并无明显的平行关系,且多在血清抗体高峰之前.因此，为达到最高的杂交瘤形成率需要有尽可能多的浆母细胞,这在最后一次加强免疫后第天取脾进行融合较适宜.已有人报道采用脾内免疫，可提高小鼠对抗原的免疫反应性，且节省时间,一般免疫3天后即可融合。 2.2.4 细胞融合
12、2.2。4。1 主要试剂的配制： q9 N： I# fw$ r/ 3 n， s） kZ： C、细胞培养基：杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI140或DMEM(Duro Modified Ealseium）两种基础培养基,具体配制方法按厂家规定的程序,配好后过滤除菌（0。22um)，分装，4保存（现实验室用的DM是ibco的高糖型液体培养基,含有aCO和L。）.9S s1 Y8 7r_ t: h不完全PM10培养基：RPMI640培养基原液9ml3S） N9 ?8 C10LG。溶液 m8 b（) 3 V / P ! I( 双抗溶液 ml75 aO3溶液 mlHEPE溶液 ml不完全DMM
13、培养基：（ D/ y（ q2Q o; o， M 超纯水或四蒸水 980lNaH3 37g ： D% E* . 7 0 y双抗溶液 10ml10。G.溶液 10lMEM 1.g3 ？4 J H, X%J+ W3 ？用1N HCl调试PH至7。27。4,过滤除菌，分装4保存.8 y9 f i/ V M1 & 完全RPMI-1640或DMM培养基：不完全培养基RPMI-140或DMM 0l小牛血清 1520ml用于骨髓瘤细胞S2/和建株后的杂交瘤细胞培养。培养基：完全RPMI1640或DMEM培养基9ml加1 C1 H& o3E F8 sT贮存液l： |： ！ 2 2 qH培养基：完全R14或DMM
14、培养基98ml加7 lz, fL X7% GHT贮存液再加7 w4 ( B。 p ， lA贮存液1m a4 P Lb、氨基喋呤（A）贮存液(10,40mol/L） ： 称取1.76mg氨基喋呤（Amoptei MW 404），溶于90l超纯水或四蒸水中，滴加1mol/LNOH 05ml中和,再补加超纯水或四蒸水至10ml.过滤除菌，分装小瓶（ml/瓶），保存（现实验室用的为瓶装HT）。 ！ M- O4 (Jc、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）贮存液（10，H：10-2mol/，T:1.613mol/L）： 称取136。1g次黄嘌呤(yoxanhine,M 36.1）和38.8mg胸腺嘧啶核苷（yine，MW242。2），加超纯水
