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1、.hTERTshRNA表达质粒的构建及鉴定胡凡果1，史玉荣2，牛瑞芳2，刘彤1，只向成3（1天津医科大学总医院普通外科300000；2天津医科大学附属肿瘤医院中心实验室300000；3天津医科大学附属肿瘤医院乳腺三科300000）通讯作者：只向成摘要目的构建针对人端粒酶催化亚基hTERT的shRNA表达质粒并加以鉴定。方法以具有G418抗性的pBAsi-hU6-Neo（BamHI/Hind）质粒构建针对hTERT的shRNA表达载体，应用基因测序加以验证。经脂质体转染shRNA质粒入乳腺癌T47D细胞，抗生素G418筛选转染成功的细胞株。采用半定量RT-PCR及westernblot法检测细胞
2、中hTERT在mRNA和蛋白质水平上的表达；TRAP-ELISA法检测细胞的端粒酶活性变化。结果成功构建了5种针对hTERT的shRNA质粒，经测序验证无误。将质粒转染入T47D细胞后经G418筛选获得了稳定转染的细胞株，hTERT基因在mRNA和蛋白水平的表达明显降低，端粒酶活性出现显著下降。结论质粒pBAsi-hU6-Neo（BamHI/Hind）可用于构建hTERTshRNA表达载体,可转染到乳腺癌T47D细胞，并能显著降低hTERT基因mRNA和蛋白的表达，进而抑制细胞端粒酶活性不精炼。主题词端粒酶；人端粒酶逆转录酶；RNA干扰；乳腺癌Constructionandidentifica
3、tionofhTERT-targetedshRNA-expressingplasmidHUFan-guo,SHIYu-rong,NIURui-fang,LIUTong,ZHIXiang-chengAbstractObjectiveToconstructandidentifyahTERT-targetedshRNA-expressingplasmidvector.MethodTheplasmidpBAsi-hU6-Neo（BamHI/Hind）whichisimmunetoantibioticG418wasusedtoconstructshRNA-expressingvectorandident
4、ifiedbygenesequencing.PlasmidwastransfectedintobreastcancercellT47DwithliposomeandthosecellsexpressingshRNAwereselectedbyG418.RT-PCRandwesternblotwereusedtodetecttheexpressionofhTERTonmRNAandproteinlevel.ThetelomeraseactivitywasexaminedbyTRAP-ELISA.Results5kindsofhTERT-targetedshRNA-expressingplasmi
5、dweresuccessfullyconstructed,whichwasprovedbygenesequencing,andtheywereintroducedintobreastcancercellT47D.TheexpressionofhTERTdecreasedbothonmRNAandproteinlevel,andtelomeraseactivitywasinhibitedatthesametime.ConclusionTheplasmidpBAsi-hU6-Neo（BamHI/Hind）canbeusedtoconstructshRNA-expressingvectorandtr
6、ansfectedintobreastcancercellT47D.TheshRNA-targetedhTERT-expressingvectorcaninhibittheexpressionofhTERTonbothmRNAandproteinlevelandthenreducethetelomeraseactivity.keywordstelomerase;hTERT;RNAi;breastcancer端粒酶的活化与恶性肿瘤的发生、发展密切相关，通过激活端粒酶，端粒DNA得以延长从而使细胞获得永生化。端粒酶逆转录酶（telomerasereversetranscriptase,TERT）是
7、端粒酶的活性亚基，一般只在永生化细胞中表达1，抑制其表达可明显降低细胞端粒酶活性2。RNA干扰技术（RNAinterference,RNAi）通过双链RNA（doublestrandedRNA，dsRNA）产生序列特异性的转录后基因沉默，在哺乳动物细胞内可高效特异地阻断特定基因的表达3，其沉默效果具有高效、特异、持久等特点，现已作为一种成熟的技术广泛应用于基因的沉默研究。本研究拟构建针对人端粒酶催化亚基hTERT的短发夹状RNA(shorthairpinRNA,shRNA)表达质粒，使其在乳腺癌细胞T47D中稳定表达特异性shRNA，检测其对hTERT基因表达和端粒酶活性的影响。材料与方法11
8、材料：质粒pBAsi-hU6-Neo、各种限制性内切酶以及cDNA第一条链合成试剂盒购自大连宝生物公司（TaKaRa）；中量质粒提取试剂盒、PCR反应预混Taq酶ColorlessGoTaqMastermix购自Promega公司；转染试剂Lipofectamine2000TM、RNA提取试剂Trizol为Invitrogen公司产品；G418购自美国Sigma公司；hTERT兔抗人多克隆抗体为SantaCruz公司产品，HRP标记的山羊抗兔二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；ECL化学发光试剂购自Pierce公司；TRAP-ELISA端粒酶活性检测试剂盒购自罗氏公司；RPMI1640培养基
9、、胎牛血清为Hyclone公司产品；乳腺癌细胞T47D为天津医科大学附属肿瘤医院中心实验室保存。12质粒的构建：根据TaKaRa公司siRNA的在线设计软件，针对编码hTERT蛋白的mRNA序列（GenBank序列号NM198253）设计合成4对针对hTERT基因的干扰核苷酸序列，分别对应于mRNA的4个不同部位，任意取其中一条链随机打乱核苷酸排列顺序作为阴性对照链，分别命名为siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA4和siRNA2-Negative(siRNA2-N)。每条序列包括：两端酶切位点序列（BamHI/Hind），两条反向互补排列的19个碱基的hTERT特异序列，中间加
10、上loop环9个核苷酸序列，作为终止信号的6个胸腺嘧啶核苷酸（表1）。将合成的5对序列用TaKaRaPCRThermalCyclerDiceTP600进行退火，使用TaKaRaDNALigationKit（CodeNo.D6022）中的Solution分别将退火产物与pBAsi-hU6-Neo（BamHI/Hind）载体连接后，热转化至大肠杆菌DH5中，涂布于含链霉素的平板上，37过夜培养，分别从平板上挑取菌落，小量扩增后提取质粒，用引物pBAsi-R：5-TGGCGAAAGGGGGATGTGCT-3进行测序，挑选测序结果正确的菌落在摇床上37过夜培养(250r/m)，按试剂盒说明提取纯化质粒
11、。13细胞培养、转染及筛选：复苏冻存的T47D细胞，用含10%胎牛血清（fetalbovineserum,FBS）的RPMI1640培养基于37、5%C02培养箱中培养，定期观察细胞生长状态，当细胞生长至融合度达90%时传代至12孔板，至细胞生长至80%融合度时进行质粒转染，按Lipofectamine2000TM转染试剂说明书操作。实验设正常细胞对照组、4个实验组、1个阴性对照组，每组细胞设三孔。转染后6h，弃去转染液，更换为10%FBS的RPMI1640培养基。48小时后更换为含有500ug/mlG418的培养基，每3天左右更换一次，每天观察细胞生长情况，20天左右可见抗性细胞克隆形成，以
12、维持浓度250ug/ml的G418培养基扩增培养。14RT-PCR检测hTERTmRNA的表达：采用Trizol一步法提取细胞总RNA，取1ugRNA进行逆转录，按试剂盒说明操作合成cDNA。PCR按Promega公司预混的Taq酶ColorlessGoTaqMastermix说明书操作进行，特异性hTERT扩增的正向引物序列为：5-GAGTGTCTGGAGCAAGTTGCAAAG-3,反向引物序列为：5-CACGACGTAGTCCATGTTCACAATC-3，扩增片断187bp。特异性-actin扩增的正向引物序列为：5-ATCTTCAAACCTCCATGATG-3，反向引物序列为：5-AC
13、CCCCACTGAAAAAGATGA-3，扩增片段136bp。反应条件为：955min灭活逆转录酶，95变性30s，61退火30s，72延伸20s，共35个循环，最后72再次延伸10min。取10ulPCR产物行2%琼脂糖凝胶（含EB0.5ug/ml）电泳，凝胶成像仪分析，mRNA表达量比较用目的条带的吸光度值与内参照条带的吸光度值之比做对比。1.5westernblot检测hTERT蛋白的表达：收集经G418筛选的细胞，PBS缓冲液洗涤细胞2遍以细胞裂解液（RadioImmunoPrecipitationAssay,RIPA）裂解细胞，冰上放置30min，4，12000g离心20min，取上
14、清进行蛋白质定量，取50ug蛋白质加入2上样缓冲液，经1005min变性后用8%的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），以转膜仪（大连竞迈生物）将蛋白质半干转至PVDF膜（Pierce）上，用含8%脱脂奶的TBST缓冲液室温封闭2h，加入1：500稀释的hTERT一抗（兔抗人IgG多克隆抗体，SantaCruz）室温孵育2h，TBST洗涤3次，每次10min，加入1：3000稀释的二抗（辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG，北京中杉金桥生物技术有限公司）室温孵育1h，TBST洗涤三次，然后加入ECL化学发光底物（Pierce公司产品），暗室中X光胶片曝光2min，以曝光条带的灰
15、度值分析hTERT蛋白的表达量高低。同时设立-actin为内参照。1.6端粒酶活性测定：采用以PCR法为基础的TRAP-ELISA法检测端粒酶活性，按试剂盒TeloTAGGGTelomerasePCRELISAPLUS（Cat.No.12013789001,Roche）说明操作。端粒酶活性按试剂盒说明书提供的公式计算，以RTA(RelativeTelomeraseActivity)表示。1.7统计学方法：统计学分析采用SPSS13.0软件，两组间比较采用两个独立样本的t检验。结果2.1hTERTshRNA的质粒构建和鉴定：测序结果显示，hTERT基因的5条shRNA双链均成功地与质粒pBAsi
16、-hU6-Neo连接（图1-图5）。2.2转染后hTERTmRNA表达的变化：hTERTshRNA质粒DNA转染T47D细胞后，各组hTERTmRNA表达量变化不一，siRNA1和siRNA2-N组变化不明显，而siRNA2、siRNA3和siRNA4组则明显降低，以siRNA4组下降最为明显（图6）。经灰度值比较计算，同T47D对照细胞相比，siRNA2组下降57.1%（P0.05），siRNA3组下降53.7%（P0.05），siRNA4组下降70.0%（P0.05）。2.3转染后hTERT蛋白的表达变化：hTERTshRNA质粒DNA转染T47D细胞后，siRNA1和siRNA2-N组hTERT蛋白的表达变化不明显，而siRNA2、siRN
