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1、.Western blot前蛋白的准备1、取得组织或细胞后，下面用细胞举例：2、贴壁细胞先用预冷的PBS 洗两遍，之后加入适量的强RIPA（ 300ul ）（里面加入 100的 PMSF）（RIPA的量不能太多，不然所得蛋白浓度太低），加入 RIPA 后，将细胞刮下来（组织的话，先研磨碎，在加 RIPA）；（悬浮细胞：先离心，再用 PBS重悬后，离心）3、将细胞在 RIPA 中刮下来后，转移至离心管中，置冰上，裂解20min；4、之后，离心， 4 度、 12500 转， 10min；5、然后，吸取上清，即为所提的粗蛋白；6、蛋白浓度的测定，之后将蛋白储存于-80 ；7、 从上述所提蛋白中取出一
2、部分， 如 40ul ，加入 10ul 的 5 loading buffer （蓝色），尽量算出稀释后蛋白的浓度 ；（高浓度利于储存！）8、之后将该 50ul 的蛋白煮沸 10min，储存于 -20/-80待用；Western 之前蛋白样品的处理：因为做 Western 时，各组蛋白上样量，及上样体积都应该一致；故，根据所用蛋白的浓度来确定样品处理：如：一个蛋白的浓度为：20ug/ul ；,.一般上样量为 20-100ug，上样体积为 10-30ul( 一般 10/20ul) （视情况而定，如果所跑的蛋白本来表达较高，可以减少上样量；而如果所跑蛋白表达较少，可以提高上样量） ，下面以 50ug
3、，10ul 为准，故要取出 2.5ul蛋白，然后加入 1 loadingbuffer将体积补到 10ul 即可。是根据上样量，算出所需的蛋白样品体系，之后用1loadingbuffer补齐到上样体积。Western Blot蛋白样品制备（一）单层贴壁细胞 总蛋白的提取：1、 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。2、 每瓶细胞加3ml 4 预冷的PBS（ 0.01MpH7.2 7.3 ）。平放轻轻摇动1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。3、
4、按 1ml 裂解液加 10 l PMSF（ 100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）4、 每瓶细胞加400 l 含 PMSF的裂解液，于冰上裂解30min ，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。5、 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml 离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）,.6、 于 4下 12000rpm 离心 5min。（提前开离心机预冷）7、 将离心后的上清分装转移倒0.5min 的离心管中放于 20保存。（二） 组织中 总蛋白的提取 ：1、 将少量组织块置于 1 2ml 匀浆器中球状部
5、位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。2、 加 400 l 单去污剂裂解液裂（含 PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。3、 几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。4、 裂解 30 min 后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml 离心管中，然后在4下 12000rpm 离心5min，取上清分装于0.5ml 离心管中并置于 20保存。（三）加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取：1、 将培养液倒至15ml 离心管中，于2500rpm 离心 5min。2、 弃上清，加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm 离心 5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。3、 用枪洗干上清后，加100 l 裂解液（含PMSF）冰上裂解30min ，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。4、将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4、 12000rpm 离心 5min ，取上清分装于0.5ml 离心管中并置于 20保存。,.
