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1、模块七蛋白质之间的相互作用1. 实验目的本实验以重组质粒和酵母细胞为材料，学习检测蛋白质相互作用的基本原理和 技术方法。主要介 绍酵母双杂交的基本原理与操作技术；让学生了解和掌握酵母 双杂交系统的应用；掌握酵母感受态的制备的基本原理和主要的操作步骤。2. 实验原理1989年Fields和Song等人根据当时人们对真核生物转录起始过程调控的 认识（即细胞内基因转 录的起始需要转录激活因子的参与，提出并建立了酵母双杂 交系统。该系统作为发现和研究活细胞 体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的 技术平台，近几年得到了广泛的运用和发展。相比于其它蛋白质筛选系统，酵母双杂交系统具有以下优点：（1检测在真核
2、活 细胞内进行，在一定程度上代表细胞内的真实情况。（2作用信号是在融合基因表 达后,在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。（3 检测结果是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱或暂时 的相互作用。（4酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期 材料构建cDNA文库,能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位 及功 能蛋白。（5通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母表型、 X-Gal及HIS3蛋白表 达等检测方法均很敏感。酵母双杂交系统也具有一定的局限性。首先，经典的双杂交系统分析蛋白间 的相互作用定位于细 胞核内，因
3、而限制了该系统对某些细胞外蛋白和细胞膜受体 蛋白的研究。酵母双杂交系统的另一个局限性是“假阳性”。在酵母双杂交系 统建立的初期阶段,由于仅仅采用。-半乳糖苷酶这一单一的报告基因体系，这种 报告基因的表达往往不能十分严谨地被控制，因此容易产生假阳性。由于某些蛋白 本身具有激活转录的功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构 域融合蛋白在无特异激活结构域的情况下也可被激活转录。另外某些蛋白表面含 有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物,从而引起报告 基因的表达，产生“假阳性”结果。产生“假阴性”结果的原因可能有许多蛋白质 间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、磷酸化
4、和二硫键形成，还有些蛋白的 正确折叠和功能有赖于某些非酵母蛋白的辅助等。现在的酵母双杂交系统大都采用多种报告基因，如AH109酵母株含有三类报告 基因一ADE2、HIS3、MEL1/lacZ，这三类报告基因受控于三种完全不同、异源性 的GAL4-反应元件和三类启动子元件-GAL1、GAL2以及MEL1（如图6-1-1。通 过这种方法就消除了两类最主要的假阳性，一类是融合蛋白可以直接与GAL4结合 位点结合或者是在结合位点附近结合所带来的假阳性；另一类是融合蛋白和某种 转录因子结合后再结合到特定的TA TA盒上所带来的假阳性。ADE2 一种报告基 因就已经能够提供较强的营养选择压力，这时选择性地
5、使用HIS3报告基因，一来 可以降低假阳性率;二来可以控制筛选的严格性（如果需要筛选与诱饵蛋白具有较 强结合的蛋白，就可以同时使用ADE2、HIS3两种报告基因；如果只需要筛选与 诱饵蛋白具有中等强度或较弱结合的蛋白，就可以使用ADE2或HIS3两者中的一 种。MEL1和lacZ分别编码a-半乳糖苷酶和。-半乳糖苷酶，可以作用于相应 的底物X-a-Gal和X-P-Gal使酵母变蓝。其中，a -半乳糖苷酶是外分泌酶，在酵 母表面就能直接检测到；P-半乳糖苷酶是内分泌酶，需要将酵母破碎后才能检测 到。用蓝斑显示酵母细胞内两个蛋白的相互作用的方法不仅具有较高的敏感性， 而且蓝斑的深浅还可以反映两个蛋
6、白相互作用的强弱。随着酵母双杂交系统的广泛应用，这一系统得到了不断的完善及改进，除了经 典的双杂交系统以外卜，同时也衍生出单杂交系统、三杂交系统、反向酵母双杂交系 统、hSos/Ras 募集系统（hSos/Ras recruitment systems、泛素分裂系统 （Split-ubiquitin systems、双诱饵系统（Dual-bait systems 等一系列相关系 统，根据这些系统的不同特点，可以分别应用于蛋白质与DNA、RNA的相互作用、 蛋白质复合体之间的相互作用、膜蛋白质之间的相互作用、筛选阻断蛋白间相 互作用的药物等一系列领域，对经典的酵母双杂交系统起到了很好的补充，并有
7、力 地推动了酵母双杂交系统的发展与应用。酵母双杂交系统的原理是利用转录激活因子在结构上是组件式的，即这些因子 往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中有DNA结合结构域（DNA binding domain, DB和转录激活结构 域（activation domain, AD，它们是转录激 活因子发挥功能所必需的。单独的DB虽然能和启动子结合,但是不能激活转录。 而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功 能。根据转录因子的这一特性，将BD与已知的诱饵蛋白质X融合,构建出BD-X 质粒载体；将AD基因与cDNA文库，基因片段或基因突变体（以Y表融合，构建 AD
8、-Y质粒载体。两个穿梭质粒载体共转化至酵母体内表达。蛋白质X和Y的 相互作用导致了 BD与AD在空间上的接近，从而激活UAS下游启动子调节的酵 母菌株特定报告基因（如LacZ , HIS 3, LEU 2等的表达（图6-1-2 ,使转化体由 于HIS3或LEU2表达,而可在特定的缺陷培养基上生长,同时因LacZ表达而在 X- a -Gal存在下显蓝色。酵母双杂交原理示意图3. 实验仪器微量取液器（2 口 L; 20 口 L; 200 口 L; 1,000 口 L、低温离心机、台式离心 机、琼脂糖凝胶电泳系统、蛋白凝胶电泳系统、凝胶成像系统、半干转移系统、 恒温摇床、恒温孵箱、通风橱、制冰机、振
9、 荡器、恒温金属浴、无菌接种环、10 cm培养皿、15 cm培养皿。4. 实验试剂(1 裂解缓冲液(Cracking buffer :尿素8 mol/LSDS 5 %Tris-HCl (pH 6.8 40 mmol/LEDTA 0.1 mmol/L漠酚蓝0.4 mg/ml(2各种基础培养基和营养缺陷培养基:mi nimal SD base, minimal SD agar base, YPD medium, YPD agar medium, -Leu DO supplement, -Trp DO supplement, -Leu/-Trp DO supplement, -Leu/-Trp/-H
10、is DO supplement,- Leu/-Trp/-His/-Ade DO supplement,腺苷酸(adenine , PEG8000, Carring DNA, 二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO , TE/LiAC buffur, PEG/LiAC, X- a -gal 或 X-g-gal o(3酵母质粒提取试剂盒，LB培养基，羧苄青霉素和卡那霉素。(4蛋白标准。(5 Z-buffer (pH7.0 :Na2HPO4- 7H2O 16.1 g/LNaH2PO4- H2O 5.5 g/LKCI 0.75 g/LMgSO4 - 7H2O 0.246 g/L
11、(6 Z-buffer/X-g-Gal 液体：Z-buffer 100 ml。-琉基乙醇0.27 mlX- P -Gal 储存液 1.67 ml5. 实验方法酵母的复苏与表型验证：(1复苏前12天，配制YPDA琼脂并于高压消毒后倒板。(2用无菌接菌环在酵母冻存管中挑取一小团酵母细胞,接种到YPDA琼脂板 上。(3 30 C倒置孵育35天。(4待酵母长到直径23 mm后，将其接种到不同营养缺陷型培养基上进行表型 验证。质粒转化酵母细胞(常规转化：(1挑取一直径约23 mm的酵母克隆接种到0.5 ml YPDA培养基中。(2剧烈震荡使细胞凝块均匀分散。(3将细胞转移到含有新鲜YPDA培养基的锥形瓶
12、中。(4 30C, 250 rpm,振荡孵育 1618 hr，直到稳定期(OD 6001.5。(5将过夜培养物转移到含有新鲜YPDA培养基的椎形瓶中，进一步扩增酵母细 胞。(6 30 C, 230270 rpm,振荡孵育使 OD 600 达到 0.5 0.1(-般需要 3 hr(7将细胞转移到数个50 mL离心管中，转速1 000 g,室温离心5 min。(8弃去上清,加入2550 mL消毒H 20，振荡重悬、清洗并收集细胞。(9转速1 000 g,室温离心5 min,弃上清(10加入1 mL新鲜配置的无菌的1X TE / LiAC重悬细胞。(11准备1.5 mL无菌EP管,在每个管中加入需要
13、转染的质粒以及担体 (carrier DNA 。(12加入经1X TE/LiAC重悬的感受态细胞，轻柔混匀。(13每个管中加入适量体积的1x PEG/LiAC，高速震荡混匀。(14 30 C, 200 rpm,振荡孵育 0.5 hr。(15加入适量体积的DMSO，温和颠倒混匀，不要振荡。(16 42 C水浴热休克15 min，对于大量转化,应经常摇动以混匀。(17置于冰上510 min，室温12,000 x g离心细胞5 sec。(18移去上清,根据铺的板数加入适量体积的1xTE重悬细胞。(19铺板，倒置平板于30 C孵育直到克隆出现。检测目的蛋白在酵母细胞中的表达:(1挑取一直径约2 mm、
14、含有目的蛋白基因片段的BD/X新鲜酵母克隆于5 mL 相应营养缺陷液体培养基中，30 C、230 rpm振荡孵育16 hr。(2将过夜培养物在50 mL YPDA培养基中扩大培养，30 C, 220250 rpm, 使 OD 600 值达到 0.40.6。(3 1,000 x g离心5 min,弃上清。(4加入30 mL H2O，重悬细胞。1,000 x g,离心5 min,弃上清，加入液氮 速冻沉淀。(5待液氮挥发完全以后，按照100 口 L/7.5 OD600的比例加入cracking buffer重悬细胞并移入到一个小量转化大量转化质粒DNA0.1 口g 20200 口g carrier
15、DNA 0.1 mg 2 mg 质粒*7每管中加入感受态细胞的体积根据酵母细胞的数量以及铺板的大小而定, 通常小量转化每管加入100 HL的感受态细胞；大量转化每管加入1 mL的感 受态细胞。如果长出来以后克隆太密则可适量减 少每管中加入的感受态细胞 的体积；反之则可适 当增加感受态细胞的体积。转化酵母菌结果1.5 mL 的 EP 管。(6按80 n L/7.5 OD600的比例向EP管中加入酸性玻璃微珠(glass beads 。 70 C加热 10 min。剧烈震荡1 min。(7 12,000 x g, 4 1离心5 min。将上清转移到一个新的1.5 mL EP管中， 置于冰上。(8 100 C水浴中35 min，剧烈震荡1 min。(9 12,000 x g, 4 1离心5 min。将两次上清合到一个EP管中。(10取20 nL上清,加入上样缓冲液，100 C变性5 min。(11 SDS-PAGE电泳后，采用Western blot技术检测目的蛋白在酵母细胞中的 表达情况。小规模酵母杂合(mating :(1在无菌的1.5 mL EP管,加入0.5 mL 2 x YPDA培养基。(2挑取直径约23 mm、新鲜的含有表达质粒pGBKT7-X的AH109酵母克隆 和含有表达质粒pGADT7-Y的Y187酵母克隆于上述EP管中。(3剧烈震荡1 min,使酵母细胞完全悬浮。(
