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1、DNA 重组生物试验报告试验名 基因工程试验试验类型：生物试验同组学生姓名： 课程名称： _生命科学导论试验课 _ 指导教师：成绩：一、试验目的和要求基因工程试验是生物试验中极具代表性的一局部，在此次试验中有如下目的和要求：1、通过本试验了解和把握含 GFP 基因质粒的提取和琼脂糖 DNA 电泳的等十个小试验组合而成的基因工程试验的原理和技术。2、了解生物试验的完整流程，对试验室根本操作标准与仪器设备使用方法得到初步了解，从而建立系统、有条理的试验思路。3、培育试验动手力量，在实践中加强对专业学问的认知与体会，融汇贯穿，寓学于用，感受生物学科的魅力。二、试验内容和原理基因工程又称 DNA 重组
2、技术，是将不同来源的基因依据预先设计的蓝图，在体外构建成杂种DNA 分子又称重组 DNA 分子，然后导入活细胞，以转变生物原有的遗传特性，获得品种和生产产品等。 基因工程技术为生命科学的争论供给了有力的手段， 同时为以基因工程技术为核心的现代生物技术产业的 建立奠定了扎实的根底。4基因工程技术建立的标志性试验是： 1972 年，美国斯坦福大学的伯格 P.Berg 等人将猿猴病毒 SV40 的 DNA 和大肠杆菌 噬菌体 DNA 分别进展 EcoRI 酶切，然后用 T DNA 连接酶将两个酶切片段进展连 接，领先完成了人类历史上第一个 DNA 分子的体外重组试验， 因此荣获了 1980 年的诺贝
3、尔化学奖。 1973 年，美国斯坦福大学的科恩 S.Cohen等人在体外构建了含四环素和链霉素两个抗性基因的重组质粒， 并将其导入大肠杆菌中，获得了双抗性的大肠杆菌转化子，成功完成了第一个基因克隆试验。上述两大科研成果标志着基因工程技术的诞生。一个典型的基因工程技术包含以下几个步骤：1. 目的基因和载体 DNA 的猎取。2. 目的基因和载体 DNA 的限制性内切酶的酶切消化。3. 酶切后的目的基因和载体 DNA 的体外重组连接，以获得重组 DNA 分子。4. 通过细菌转化等技术，将重组 DNA 分子导入细菌等活细胞。5. 转化细胞的筛选鉴定以及目的基因表达的检测。其中目的基因、载体、工具酶及宿
4、主细胞是缺一不行的，因此被称为基因工程的四大要素。试验一 含 GFP 基因质粒的提取目前猎取目的基因 DNA 片段常用方法是：从 Gene Bank 中查得目的基因的 DNA 序列，依据序列设计引物，通过 PCR 的方法扩增目的基因的 DNA 片段。依据目的基因的来源不同，用于 PCR 扩增的模板 DNA，大致有两个来源：由于真核细胞 DNA 的基因 编排方式，是由内含子和外显子等组成，因此，只能通过提取目的基因的mRNA，逆转录合成出 cDNA，作为 PCR 的模板。原核生物的 DNA 其基因是连续的。因此提取原核细菌的 DNA，就可用于 PCR 的扩增。本次试验的目的基因就是来自一种细菌编
5、码的脂肪酶基因。细菌基因组 DNA 的提取先是用溶菌酶及蛋白酶 K 裂解细胞， 释放 DNA、RNA 及蛋白质等。 然后用苯酚/ 氯仿处理，使蛋白质变性，经离心去除蛋白质及细菌碎片，DNA 和 RNA 存在于上清水相中，然后用 RNase分解 RNA，酒精沉淀 DNA，即可猎取目标基因组 DNA。试验二 琼脂糖 DNA 的电泳DNA 分子是两性电解质， 在溶液中形成兼性离子而携带电荷， 带电分子在电场中将产生移动， 这种现象称为电泳。带电分子在电场中移动的快慢，除受到场强、缓冲液类型及缓冲液离子强度等外界因素的影响 外，10还受到分子的大小、带电量及分子的形态等自身因素的影响。为避开断电后电泳
6、分开不同快速集中混合， DNA 电泳常承受琼脂糖的凝胶电泳。试验三 PCR 扩增目的基因DNA 分子的1985 年美国 Cetus 公司的穆利斯等人设计并争论成功了一种体外核酸扩增技术 PCR Polymerase Chain Reaction ，从而荣获了 1993 年诺贝尔化学奖。这种聚合酶链式反响是一种类似于细胞内 DNA 的天然复制过程，利用半保存复制的原理，以待扩增的DNA 为模板，在体外由引物介导的酶促合成特异的DNA片段。将目的基因 DNA 在高温 94下解链成为单链模板；人工合成的一对与目的基因两侧序列相互补 的寡核苷酸引物在低温 40 60下分别与变性的目的基因片段两侧的两条
7、链的局部序列互补结合；在 中等温度 6575下由耐热 DNA 聚合酶 Taq酶将 dNTP 中的脱氧单核甘酸加到引物 3”-OH 末端， 并以此为起点， 沿着模板以 5” 3”方向延长， 合成一条的互补链。 合成的 DNA 链的起点是由参加的 引物在模板 DNA 链两端的退火位点打算的。由于 PCR 反响中，双链 DNA 高温变性成单链，引物与模板单链 DNA 低温退火配对 ，适温下引物延长 3 个步骤反复循环，每一循环所形成的 DNA 分子均能成为下一循环的模板，所以 PCR 的特定目的 DNA 产物以指数方式递增，在数小时内，经过 30 个循环后，理论上可使 DNA 扩增至 10 亿 23
8、0=109倍。并且原来对单拷贝基因进展探测和分析时需用 10g 基因组 DNA，现在可以削减到 ng 水平。样品 DNA 预变性双链 DNA 解链， 94 5min引物与单链模板 DNA 结合，30 秒-双链 DNA 解链94 、 40 秒65-75 、 2min延长反响完成聚合酶合成链试验四PCR产物的纯化试验五DNA的酶切反响基因工程技术必不行少的工具酶之一，是限制性内切酶，它能识别和切割双链DNA 分子内特别碱基序列。依据其构造和作用特点分成型、型及型 3 大类，型和型核酸限制性内切酶一般由两个亚基 构成，既具有内切酶的活性，又有甲基化酶的活性，型和型识别位点固定但酶切位点不固定。而型
9、酶其核酸内切酶活性和甲基化酶作用活性是分开的，而 II 型酶识别位点固定同时酶切位点也是固定的， 因此基因工程中应用的是型核酸限制内切酶。核酸限制性内切酶的命名： 以 EcoRI 为例，第一个大写字母 E 为大肠杆菌的属名的第一个字母； 其次、 三个字母 co 为大肠杆菌的种名的头两个字母；第四个字母 R 为大肠杆菌的菌株名；最终一个罗马数字表 示该细菌中已分别出这类内切酶的挨次编号。试验六 DNA 酶切产物的过柱纯化试验七 质粒的提取将一个有用的目的 DNA 片段通过体外重组技术，转移进宿主细胞中进展生殖及表达的工具称为载体。 载体种类很多，依据目的不同选用相应的载体，其中质粒是最常用的载体
10、。质粒( plasmid )是一种独立于染色体之外的双链 DNA，可自主复制、携带了少量的遗传信息(如：抗生素抗性基因) ，自然界质粒存在于原核生物及低等的真核生物(如酵母、霉菌) ，自然界觉察的质粒均 有缺陷，必需经过改造才能应用于基因工程。抱负的质粒载体包含：一个复制起点选择性抗性标记 人工合成的多克隆位点( multiple cloning site对分子量和较高的拷贝数。， MCS)含有多个核酸限制性内切酶位点具有较小的相pBSSK 质粒的图谱试验八 DNA 的重组连接质粒与目的基因经核酸限制性内切酶酶切后形成的 DNA 末端有两类：平末端和黏性末端。依据肯定比例将质粒和目的基因混合后
11、，参加连接酶， DNA 连接酶能酶促合成相邻核苷酸之间的单链缺口， 形成磷DNA酸二酯链，很明显，含黏性末端的 DNA 片段之间的连接效率，要明显高于平末端的 DNA 片段间的连接。质粒具有不相容性( incompatibility )或不亲和性，是指在没有选择压力的条件下，两种亲缘关系 亲热，携带一样复制原点的不同质粒不能在同一宿主细胞内稳定地共存的现象。质粒的提取常用碱法提取： 利用外表活性剂 SDS 溶解细胞膜上的磷脂和蛋白质， 在 PH 高达 12.6 的碱性条件下使染色体 DNA 变性，而分子量较小的质粒 DNA 只是局部变性，当醋酸钾重调回PH 至中性时，质粒复性恢复原状，而该复性
12、条件下染色体 DNA 不能完全复性而形成缠连的网状构造，与菌体蛋白及细菌碎片凝集成块，经离心去除，而上清中含有质粒 DNA、少量蛋白及 RNA，经去除蛋白及 RNA 后，即可猎取质粒 DNA。试验九 感受态细菌的制备DNA 重组分子体外构建完成后，必需导入特定的宿主(受体)细胞，使之无性生殖并高效表达外源基 因或直接转变其遗传外形，这个导入过程及操作统称为重组DNA 分子的转化( transformation )。在原核生物中，转化是一个较普遍的现象。在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与宿主菌两者在进化过 程中的亲缘关系，另一方面还与宿主菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。所谓感受态，
13、即指宿主细胞最易承受外源 DNA 片段并实现其转化的一种生理状态，它是由宿主菌的遗传特性所打算，同时也受菌龄、外界环境因子等影响。据报道cAMP 可以使感受态水平提高 10000 倍，而22600Ca2+也可大大促进转化作用。细胞的感受态一般消灭在指数期，颖柔嫩的细胞是制备感受态细胞和进展 成功转化的关键。 对于 Ca2+诱导的完整细胞转化而言， 菌龄、CaCl 处理时间、感受态细胞 ( competent cell ) 的保存期以及热击时间均是很重要的因素，其中感受态细胞通常在12 24h 内转化效率最高，之后转化率急剧下降。因此在制备感受态细胞时，将细胞培育至OD 为 0.4 0.6 后放
14、入冰浴中使其终止生长，然后将菌株置于低温与处理的低渗 CaCl 溶液中，即造成细胞膨胀，使细胞通透性发生短暂性变化，从而极易与外源 DNA 相黏附并在细胞外表形成复合物。此时，将该体系转移到 42下做短暂的热击( heat shock )，外源 DNA 就可能被细胞吸取。进入宿主细胞的 DNA 分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，是宿主细胞消灭的遗传性状。将经过转化的细胞在筛选培育基里培育，即可筛选出转化子( transformant )，即 带有异源 DNA 分子的宿主细胞。试验十 重组质粒 DNA 的转化外源 DNA 与载体分子的连接即为 DNA 重组技术，重组的 DNA 分子式在 D
15、NA 连接酶的作用下，有 Mg2+、ATP 存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA 分子连接起来。将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培育基中培育，可以通过各种方法筛选出重组子，并可通 过酶切电泳进展重组子的鉴定。三、主要仪器设备在基因工程试验中用到的仪器主要包括：旋涡混合器、离心机、电泳槽、烘箱、PCR 仪、冰箱等。此外，试验中所用工具还包括常见试验工具如：离心管、移胶板、 eppendorf 管、移液器等。四、操作方法和试验步骤试验一 含 GFP基因质粒的提取试验步骤：1. 取菌液 0.51ml，12023r/min 离心 10 秒钟，弃上清液2. 在旋涡混合器上振荡混匀至沉淀彻底分散3. 参加 400uL 含溶菌酶的 GTE 溶液(含葡萄糖、 Tris-Hcl 缓冲液和 EDTA)，在旋涡混合器上振荡混匀至沉淀彻底分散4. 37 度保温 20
