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1、使用酶标记的肽模拟表位作为示踪剂利用竞争性免疫分析检测抗原摘要：模拟表位肽肽模拟半抗原，与相应的单克隆抗体共轭过氧化物酶，竞争 性结合的免疫学实验。所建立的确定半抗原浓度的定量分析方法。这里所描述的 模拟实验系统，我们使用单克隆抗体B13-DE1与荧光素和相应的模拟肽的结合。 D 2002 Elsevier 科学有限责任公司保留所有解释权。1. 引言合成肽已被用于科学研究、医药学和生物学等许多不同领域（Van Regenmortel and Muller, 1999）.。很多实验都是用的肽而不是全蛋白，例如，合 成肽在疫苗和免疫分析实验上就应用的非常成功。由于肽的合成价格低廉，因此 已经成为一
2、种常规实验方法。因为可以通过已知的 DNA 序列合成短的肽链，再 通过对应的抗体抗原反应可以识别相应的蛋白质，因此目前通过合成肽研究未知 基因产物非常热门。另一方面，噬菌体是肽的天然图书馆（Scott and Smith, 1990）， 目前，利用合成肽制备单克隆抗体，再通过单克隆抗体鉴定抗原表位应用得非常 广泛。在一些情况下，通过合成肽所鉴定的结构并非真正的抗原表位，但可以通 过与抗体结合的部位模拟抗体表位。这样的模拟表位还可以检测非蛋白质表位 （Bottger et al., 1999; Kieber-Emmons, 1998;Skerra and Schmidt, 1999）。这些模拟表
3、 位还有一些独特的功能，例如，在免疫方面，在一些情况下原始表位很难分离， 模拟表位的价值在这里就体现出来了。模拟表位在代替抗原进行免疫测定方面也非常有价值。利用这种原则设计的 的第一法是由“yuan等人在一次利用免疫法测定霉菌毒素（deoxynivaenol）中 提出的（1999）。在这里，我们描述了一个通过半抗原荧光法测定的，单克隆抗 体 B13-DE1 和荧光素、模拟表位肽竞争性结合的，免疫分析实验。2 材料与方法2.1 抗体此实验所使用的单克隆抗体B13-DE1由我们实验室生产。B13-DE1与荧光 素反应强烈，6-羧基荧光素和异硫氰酸（FITC）所标记的蛋白质，与比他们低3 个数量级的
4、相关分子结构反应产生酚红色。2.2合成肽与单克隆抗体B13-DE1结合的模拟表位肽最初从噬菌体肽库中筛选而来 （Bottger et al., 1999）。这里所使用的肽由Biosyntan （柏林）通过原始的三个模拟 表位所合成，含有以下氨基酸序列的肽S-940被用于此次描述性实验，因为它在 几个不同实验中都可以与单克隆抗体B13-DE1发生反应：ADGAGSWGEWGA- （之中的下划线序列已由噬菌体证明为模拟表位）。2.3 肽过氧化物酶结合物根据赫曼森所描述的略作修改后的标准方法（1996），模拟表位中的N-末端 与辣根过氧化物酶（HRP。发生偶联而体现荧光性（HRP; Roche Di
5、agnostics, Mannheim）。0.5mg的肽与1.5mg辣根过氧化物酶偶联。2.4异硫氰酸（FITC。与牛血清蛋白（BSA。和辣根过氧化物酶（HRP。的偶联 作用根据赫曼森所描述的略作修改后的标准方法（1996）,牛血清蛋白（BSA） 和辣根过氧化物酶（HRP）中的-NH2与荧光素发生偶联（共轭）。lmg的蛋白质 与0.2mg的异硫氰酸（TITC）偶联。2.5 竞争性免疫分析酶联免疫吸附条纹板（Nunc）包被纯化的抗体B13-DE1 （每孔加50ml的 5mg/ml的PBS培养1夜），用自来水冲洗，并在每孔中加入100ml具有阻遏作 用的M-PBS在室温下静置30min，然后每孔加
6、入50ml混合物（预先在室温下放 置30min）, HRP-肽偶合物（M-PBS 1:500稀释）或者FITC-HRP偶合物以及不 同浓度的荧光素或荧光素衍生物，室温下培养 4小时，所有条纹上的每个孔用 200毫升0.1%的Triton X-100，0.5mol氯化钠，PH为7.5的10nml三羟甲基氨基 甲烷试剂冲洗10次。ABTS（罗氏诊断，曼海姆，50毫升/孔）用作检查固相结合 过氧化物的底物。20min后将反应物在酶联免疫测定仪405nm波长测定。2.6 含量验证通过5 天内分别重复5 次试验间的精密度对实验结果进行评价。对于检测而 言，制备一批更多更新的模拟表位结合物-HRP，比使用
7、第一批精度要有所提高。 对于所有的测定，所使用的材料全部相同，包括样品的校准曲线。对于荧光素的 含量，是事先由另一个人准备好的 4个不同样品进行测定的。其中两个样品选择 在测定的校准范围内，两个样品选择在测定的校准范围外。该软件 GraphPad Prism是专门为由单独测得的吸光计算吸浓度而设计的，同时还可以对5个实验 间的变异系数进行统计分析。3 结果实验发现对S940-HRP偶合物进行1:500的稀释，可以得到最佳测定浓度。 由于S940-HRP偶合物与固相固定抗体B13-DE1的结合受到FITC标记的牛血清 蛋白的抑制作用，实验证明未结合的荧光素和各种相关化合物也会产生相同的竞 争效应
8、。荧光素作为HRP共轭肽与B13-DE1结合的最有力抑制剂横空出世。与 之密切相关的 6-羧基荧光素的抑制作用相对较低，酚红的抑制效率甚至更低。甲 酚红对HRP共轭肽的结合作用几乎没有抑制作用（图1）。与先前文献中所提到 的 6-羧基荧光素和 B13-DE1 结合能力相比，此实验所证明的结合能力明显较弱 （Bottger et al., 1999; Micheel et al.,1988）。改变一定的测定条件，特别是对孵化期的改变，可明显提高荧光素测定的灵 敏度。通过对测定条件的优化，特别是对孵化期优化，可以使荧光素测定校准范围 达到 5-30ng/ml。03100.0 +10Fluoresc
9、ein-o- Carboxy fluoresceinPhenol Red心一 Cresol Red0.2109hapten ng/ml图1图 1 ，荧光素衍生物及相关染料对 S940-HRP 偶合物与固相 B13-DE1 结合的抑制 能力。FITC-HRP图2S940-HRP图 2 ，荧光素对 S940-HRP 和 FITC-HRP 与固相 B13-DE1 结合的抑制能力。由于S940-HRP偶合物能有效测定荧光素含量，这里我们以FITC-HRP偶合 物（1:100000 稀释）作为示踪物质与之一起比较。通过对稀释曲线的比较，这两 种检测方法灵敏度相当，以两种偶合物作为示踪物质测定荧光素含量的
10、方法显示 无差别。模拟表位肽偶合物的灵敏度略高（图 2）。这一系列对荧光素样品测定的竞争性分析实验，变异系数在 3%-9%之间的 在校准范围内（即在抑制曲线的线性范围内）在 15%-17%之间的不在矫正范围 内。（表 1） 表1荧光素抑制S940-HRP和B13-DE结合的批间实验数据。Table I erwceti-assay vaidaridata wlicti inliibititig die bitiditig S940-IIRP ciHijugarc ro solid pliase B 13-DEI by iluoresccinXutnber ofSample A Sample B
11、Sample 匚 Sample Dassay10.93390.67650.5089().179120.9 J 440.68J50,49350.230730.87J6().66170.5035().259640.85570.6599).47920.27385O.6J3J0.54 LH0.4765().197SMeancoticetirrariiHi0.83770.6443).49230.2282匚ocfiicictii: of variatiotiJ 5.45%9.0J%2 .9 J %17.53%表14 讨论本文介绍了利用竞争性免疫的方法测定半抗原浓度。本实验建立起一个以半 抗原，荧光素，抗荧
12、光素抗体 B13-DE1 和模拟表位肽为模型的模型系统。固定于条纹板孔表面的肽模拟表位和HRP的偶联物，与单克隆抗体 B13-DE1竞争性与荧光素或相关物质结合。三个原始的模拟表位肽偶合物（S940, 模拟表位序列在GSWGEW中）只有一个适用于该检测方法。我们的研究结果表 明，这种模拟表位肽法可以建立一个简便、灵敏的检测方法，以定量确定低分子 量物质。实验表明，使用FITC-HRP偶合物作为示踪分子进行竞争性免疫检测具 有相同的灵敏度。它甚至可能有更好的特异性，因为 6-羧基荧光素没有表现出与 其他荧光素一样的竞争性。但在进一步实验中得到了澄清。我们的验证数据已经证明该实验的可靠性和可重现性
13、。我们发现它们在 Wild1994年的文献中所描述的传统竞争性免疫的测定法的范围内。除了验证数 据以外通过比较抗原和表位的结合的交叉实验已经证明了模拟表位的潜在价值。当传统的半抗原检测失败或难以建立时，模拟表位肽在竞争激烈的免疫检测 中的价值就体现出来了。一种替代半抗原（抗原）偶合物的免疫测定方法是利用抗独特型抗体 （Langone and Bjercke, 1989）。然而，由于抗独特型抗体在大多数情况下亲和性远 高与半抗原（抗原）的抗体，在这些情况下使用抗独特型抗体往往不够灵敏，因 此只适用于特殊情况。模拟表位是否可被多种半抗原所选择，迄今已知的模拟表 位不是一个例外而是一种规律，这些都有待证明。由于通过生产杂交瘤细胞或使 用大的抗体库，利用与半抗原的反应，抗体很容易被找到，这一点也很有实际作 用，也可以预期，至少其中一个抗体会与从肽库中检测到的肽的模拟表位反应。 尽管肽的模拟表位的搜索非常繁琐，当半抗原稳定性差难以灵活使用时，尤其是 在十分有价值的有毒有害物质测定的实际应用中，这种方法还是很有用的。
