《-湖北省自然科学基金--莲藕遗传多样性及种质分子标记分析与鉴定》由会员分享，可在线阅读，更多相关《-湖北省自然科学基金--莲藕遗传多样性及种质分子标记分析与鉴定（17页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、附件8：湖北省自然科学基金计划重大项目申 请 书项目名称：莲藕遗传多样性及种质分子标记分析与鉴定申请者： 丁 毅所在单位：武汉大学邮政编码：430072通讯地址：武汉大学生命科学学院单位电话：68772100手机： 传真： 68754319电子信箱：.申请日期：2005年10月29日湖北省科学技术厅制2005年9月一、基本信息表研究项目名称莲藕遗传多样性及种质分子标记分析与鉴定摘要针对莲藕遗传多样性及种质分子标记分析与鉴定等基础研究薄弱的现状，采用DNA分子标记（AFLP、SSR、ISSR）和蛋白质组分析技术，探讨莲藕基因组与莲藕种质资源的遗传多样性，进行亲缘关系分析与品种鉴定，构建莲藕蛋白质
2、组图谱、核心莲藕种质DNA分子标记指纹图谱，并对莲藕种质重要基因的染色体进行定位作图。帮助确立莲藕核心资源，为经济有效地保存和利用种质资源提供分子遗传学依据。充分发掘和利用国家种质武汉水生蔬菜资源圃中莲的种质资源，这对莲的理论研究、种质保存、生产利用与产业化开发具有长远的重要意义。申请金额40万元起止年月2006年1 月至 2008 年 1 月项目申请人姓名丁毅性别男民族汉证件号码481电子信箱办公电话68754319学位博士 硕士 其他学位授予国别（或地区）中国职称教 授签字手机家庭电话68766988所在单位信息名称武汉大学通讯地址武汉大学生命科学学院邮政编码430072性质高等学校科研机
3、构电话68772100（武大科技部）/87217698（生科院）信箱主要参加人员姓名身份证号码职 称现有工作单位签字柯卫东525研究员国家种质武汉水生蔬菜资源圃（武汉市蔬菜科学研究所）李立家561副教授武汉大学生命科学学院黄新芳311高级农艺师国家种质武汉水生蔬菜资源圃（武汉市蔬菜科学研究所）刘树楠4129254副教授博士生华中师范大学生命科学学院武汉大学生命科学学院汪爱华642博士研究生武汉大学生命科学学院朱小燕006博士研究生武汉大学生命科学学院马璐4201047博士研究生武汉大学生命科学学院潘磊173硕博生武汉大学生命科学学院二、立项依据研究意义、创新点和特色（2000字以内）研究意义：
4、莲藕为莲科（Nelumbonaceae）莲属（Nelumbo Adas.）多年生水生草本。莲属有莲（N.nucifera Gaertn）和美洲黄莲（N.lutea Pers）2个种，主要分布在亚洲和大洋洲。中国是莲的世界分布中心；美洲黄莲主要分布在北美洲和南美洲北部。在园艺学分类上一般将莲分为子莲、花莲和藕莲三个类型。也有人认为应将美洲黄莲作为莲的一个亚种。野生莲藕是莲的共同祖先。莲的一身都是宝，除藕及莲籽外，花、花粉、荷叶、藕节、莲芯以及它们的各种加工制品，都可以作菜肴或饮料及保健食品；莲壳和莲蓬可以提炼染料；莲叶可以作为轻工业原料，作为饲料等。莲作为一种重要的水生蔬菜，具有食用价值和经济价
5、值，同时具有观赏、园艺美化和水体净化等环境生态价值。当今荷藕已成为湖北等地农民致富、加工出口的一种特色产业，湖北武汉等地作为优势产业来发展。藕莲主要分布在湖北、江苏、浙江、安徽、江西等长江中下游地区，据统计，2003年全国总面积为27.03 万hm2，总产量为734.23万t，其中以湖北省的面积最大，为6.8万hm2，197.0万t。对其种质资源的保存、收集、应用与鉴定是莲藕产业化持续发展的基础性工作。为此，国家建立了国家种质武汉水生蔬菜资源圃，设在武汉市蔬菜科学研究所内。于20世纪80年代初，大规模收集莲种质资源，至今，从全国近20个省及日本、泰国等地征集莲种质资源近500份，其中藕莲200
6、多份，子莲20多份，花莲200多份，保存在圃内，拥有我国乃至世界上最多的莲种质资源。但是这些种宝贵种质资源的研究发掘还很不够，利用潜力还未充分发挥。在莲种质资源的收集、保存和形态学等鉴定评价的基础上，国内各相关单位广泛开展育种及推广工作。武汉市蔬菜科学研究所已选育藕莲品种鄂莲15号，近年又新育成新1号、0001、0312等新品种,成为国内藕莲的主栽品种，近年又开展花莲的杂交育种。中科院武汉植物园所选育出藕莲品种武植二号等。中国荷花研究中心重点开展花莲的育种和推广，选育出一大批花莲新品种。湖南省蔬菜科学研究所选育出湘莲1号、湘杂莲2号等子莲品种。江西省广昌白莲科学研究所开展子莲航空育种，选育出太
7、空1号、太空2号、太空3号等子莲品种。湖北省水产科学研究所选育子莲品种鄂子1号、鄂子2号等。这些在生产上广泛推广种植的品种，也是一种重要的遗传种质资源。如何更有效地发掘利用这些莲种质资源，搞清楚它们的遗传多样性和基因组结构特点，以明晰资源特点和优势，变资源优势为产业优势，为发展湖北乃至全国农业经济服务是摆在我们面前的一项重要任务。过去，在莲藕资源保存、育种及新品种推广和加工等方面开展了一些研究，在莲藕遗传多样性及种质分子标记分析与鉴定等基础性研究方面显得相对薄弱，即使在我国近年有所报道也是零散而不系统，因为他们缺少莲的种质资源。而且，在对莲进行遗传多样性分析中，多采用RAPD分子标记，其最大的
8、缺陷是不稳定，重复性差，所以可信度也差。因此需要运用稳定重复性好的AFLP、SSR、ISSR等分子标记进行分析；并且需要开展莲的重要基因染色体定位和莲的蛋白质组图谱分析等，这些在国内外权威刊物上都尚未见报道。本项目的研究意义在于： 1研究莲的遗传多样性，建立基于DNA标记的分子图谱以及叶片功能基因组（蛋白质）图谱，开展重要基因的染色体定位，将从理论上弄清莲的基因组结构特点，揭示其地理分布与多样性分布的特点，遗传变异与进化的关系，明晰种质的亲缘关系。2从生产利用上，明晰莲种质的遗传关系，为园艺学分类提供依据，可以指导运用经济有效的育种技术方法，指导育种中合理选择选配亲本，从而减少育种的盲目性，加
9、快遗传改良进程。同时可以鉴定品种、单株、突变体等的真实性，为品种知识产权保护、品种分子鉴定和选育提供技术。帮助确立莲藕核心资源，为经济有效地保存和利用种质资源提供分子遗传学依据。3. 构建起以蛋白质组和基因组DNA分析为基础的技术平台及其长效运行机制，对莲的理论研究、种质保存、生产利用与产业化开发具有长远的重要意义。 创新点和特色：1研究材料方法创新。在技术路线上，从形态学、分子遗传学和分子生物学等方面研究莲藕种质资源遗传多样性，建立近500份莲种质资源的标准DNA分子标记图谱以及主栽品种和核心种质材料的蛋白质组图谱等，明晰种质的亲缘关系，为莲育种中选择选配亲本、品种和单株及突变体等遗传甄别提
10、供准确可靠的信息。并为确立莲藕核心种质提供依据，从而指导资源的保存利用；而且率先开展莲的基因染色体定位研究；2研究的系统性和针对性强。本项目紧密结合湖北省水生蔬菜产业化发展的实际，针对莲藕遗传多样性及种质分子标记分析与鉴定等基础性研究薄弱的环节，比较系统地从基因组DNA分子标记分子生物学等角度探讨莲藕种质资源的遗传多样性和亲缘关系，提升对莲的种质资源的认识水平；3 研究实施学研强强结合。项目承担单位武汉大学生命科学学院具有较强的分子生物学等基础研究实力，武汉市蔬菜研究所具有莲藕的种质资源优势和前期资源形态学研究及新品种选育与开发经验，实现联合研究，将提升对莲资源的发掘水平，有利于进一步开展遗传
11、改良和推动湖北省荷藕产业化发展。三、研究目标及研究内容研究目标1建立起1个适合于莲藕种质资源遗传多样性分析和品种甄别的技术平台；2构建起500份左右莲藕资源的基因组DNA库；运用DNA分子标记技术对该库进行遗传多样性分析，明晰种质的遗传亲缘关系，并建立1个DNA分子标记图谱数据库；建立湖北省主栽莲藕品种和国家水生蔬菜资源圃核心莲藕种质DNA分子标记指纹图谱； 3建立湖北省主栽莲藕品种和国家水生蔬菜资源圃核心莲藕种质的蛋白质组图谱； 4开展莲藕种质重要基因的染色体定位作图；5在国内外有影响的专业学术刊物上发表研究论文5篇以上。研究内容1莲藕种质资源分析技术平台的构建：包括DNA分子标记技术（AF
12、LP标记技术的条件优化、SSR标记的引物设计、ISSR标记引物的筛选）和叶片全蛋白双向电泳技术以及基因的染色体定位分析技术；2在形态学研究的基础上从国家水生蔬菜资源圃中选取500份左右的莲藕种质（包括湖北省主栽品种及国内藕莲、子莲、花莲、野莲等各类资源、及美国、日本、泰国、印度等国外资源），从叶片中提取基因组DNA，分别运用AFLP、SSR和ISSR分子标记技术进行DNA指纹图谱的比较和遗传多样性分析，结合已有研究成果，从中筛选出核心莲藕种质材料；3，对筛选出的核心莲藕种质材料（包括湖北省主栽品种）进行叶片蛋白质组图谱分析；4在核心莲藕种质材料的基础上，选择510份代表性材料进行5SrDNA和
13、45SrDNA、端粒、着丝粒等的定位作图分析，并将一些重要功能基因如发育调控基因dad1、细胞周期基因cdc等定位在特定的染色体上。四、研究方案、技术路线及可行性分析研究方案与技术路线：1 在采用DNA分子标记对莲藕资源遗传多样性分析中，首先对所选种质材料的核基因组DNA进行提取。总DNA的提取采用CTAB法。2 核基因组DNA分子标记研究，采用AFLP标记、SSR标记和ISSR标记这3种稳定性和重复性好的分子遗传标记。AFLP（amplified fragment length polymorphism，扩增片段长度多态性）标记是利用特定的限制性内切酶酶切基因组DNA后, 以特定的限制性引物
14、接头连接在酶切后的DNA片段, 再利用特定的引物把片段DNA选择扩增, 最后用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果。按照AFLP标记分析要求进行如下步骤的操作，包括：限制性内切酶对基因组DNA的消化、连接接头、预扩增、引物标记、选择扩增反应、凝胶电泳、银染染色、染色结果拍照、计算机保存结果等。其中对预扩增和选择扩增反应的PCR反应条件要进行优化。SSR(Simple Sequence Repeat,简单序列重复)标记是带有26个碱基对重复长度的DNA序列，其重复的数目变化可根据SSR两侧的保守性序列设计引物，通过PCR来检测。在莲的核基因组中还没有公开发表的SSR引物，在本项目研究中需要进行引物的设
15、计与选择。ISSR (Inter-simple sequence repeats，)标记，可以研究简单序列重复区间扩增多态性。利用基因组中常出现的SSR本身设计引物，无需预先克隆和测序。已知有很多ISSR引物组合，本项目中要对ISSR引物对进行筛选。通过以上3种不同的DNA分子标记分析可以得到莲的不同种质资源材料特定的指纹图谱，从中可以较为清楚地知道莲的基因组遗传多样性程度，及其遗传变异与进化的关系。同时，可以初步筛选出核心莲藕种质材料。3.计算机扫描和数据处理、聚类分析将电泳结果经扫描仪扫描或数码照像转化成图象文件贮存于计算机中，以用之于数据处理、保存和刻光盘。在遗传多样性研究中，采用目前国际上通用的遗传多样性研究指标和计算方法。遗传多样性指数(Genetic diversity index)按Weir (1990)的公式计算；同一性概率(probabiltes of identity)按Paetkau et al. (1
