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1、-RNA干扰药物对大脑：进展和挑战*埃德加多罗德里格斯勒布朗，瑞安L.布德罗，1，1，：富康属戴维森1，2，3作者信息文章指出和许可证信息抽象RNAi的干扰RNAi是一个功能强大的基因沉默技术治疗人类疾病，抑制疾病相关的基因可能提供临床受益浩大的，具有巨大的潜力。在这里，我们回忆RNAi技术的开展，神经退行性疾病，影响中枢神经系统S作为一种治疗方式。我们概述前途的应用RNAi在中枢神经系统的临床前数据，并讨论关键的挑战如交付和特异性，仍然是这些方法过渡到诊所。简介早在十几年前，安德鲁消防和克雷格梅洛描述双链RNA分子的能力来抑制线虫的基因表达，生物研究1翻开一个新的前沿。这个高度特异性，在当时
2、，百思不得其解观察被称为RNA干扰RNAi。在2001年，托马斯Tuschl领导的小组发现，小的双链RNA21个核苷酸，可以在培养的哺乳动物细胞介导的RNAi，因此，他们提出，作为一个特定基因治疗人类疾病2RNAi技术可以适用。次年，几组取得有力的RNAi介导的基因抑制体，最值得一提的是，成年小鼠的肝脏和大脑3，4。总之，这些研究结果已经点燃了RNAi的开展成一系列的收购和继承人类疾病的关键基因的表达可能会抑制临床获益的治疗方法。值得注意的是，刚刚过去的一年，戴维斯等人的研究。5成功RNAi介导的沉默在人类提供了第一个分子证据。RNA干扰作为一种治疗干预的前景提供了一个时机，以治疗多种疾病的有
3、效选工程前不可用或有限。特别是，基于RNAi疗在研究的疾病，影响中枢神经系统S，包括偶发性和遗传神经系统疾病，翻译多年的科学家和临床医生带来了挑战。最近的研究利用动物模型已经承诺支持RNA干扰RNAi疗法可以改善神经病理学和行为的表型的概念证明型数据。在这里，我们简要概述RNAi途径，并介绍了各种手段，通过它可以被操纵，以到达特定基因沉默。此外，我们讨论在中枢神经系统中的应用RNAi技术，并突出其潜在的治疗神经退行性疾病。最后，我们在一些关键的挑战，仍然是RNAi技术过渡到诊所反映。转到：RNAi技术的运作RNAi是一种重要的分子机制细胞命运决定，增殖和许多生物学过程6。细胞的RNAi机制结合
4、的小分子RNA在调节基因的表达，并作为一种与生俱来的细胞反响病毒的入侵和转座子活动图17。源性RNA干扰基因调控主要是通过基因组编码小分子RNA称为小分子RNAmiRNAs的发生。成熟的miRNA19-25nt从初级miRNA的转录PRI-miRNA的，它含有茎环构造即发夹8处理。PRI-miRNA的表达后，裂解Drosha酶-DGCR8核微处理器的复杂，生产中间发夹RNA6070元，被称为前驱体微RNA前体miRNA，9，10。前的miRNA，其后E*portin将他们在那里进一步处理用的Dicer的含络合物，从而解放了小miRNA双链区域11，12的细胞质-5贩卖。将所得双工甲单链指南的反
5、义链，然后引入到RNA诱导的沉默复合物RISC，然后结合并沉默目标靶基因13，14。目标压制的模式，主要取决于的互补程度近乎完美的靶转录裂解所需的碱基配对，而不完善的绑定通常在一个目标3-UTR诱导翻译抑制mRNA的降解。后者的情况代表了典型的基于miRNA的机制，值得注意的是，互补短绵延少6-7个基点可能足以引发基因沉默15的。图1。图源性RNAi途径和手段增选机械。我们请读者最近的miRNA的生物合成和功能7深入审查。利用RNAi途径在过去的十年中，我们进一步了解miRNA的生物合成和基因沉默机制的开展促进了各种策略增选细胞的RNAi机制直接几乎所有基因的特异性沉默。这些基于RNAi技术已
6、成为珍贵的分子工具来研究基因的功能，并正在调查许多人类疾病的治疗试剂。人为地诱导基因沉默的潜力取决于我们好好搞RNAi机制抑制RNA的设计能力，向他们介绍到靶细胞或组织。中央的RNAi效应，被称为小干扰RNAssiRNAs，本质上是设计模仿成熟的miRNA双链，但表现出完美的互补预定目标成绩单触发有力裂解沉默机制与导向链图1。值得注意的是，选择强有力的和高度特异性的siRNA序列是不完全琐碎，和众多的大规模siRNA敲除研究的实证评估研究人员定义多个的siRNA设计指南14，16。例如，一个重要的考虑因素是，siRNA序列应选择或操纵到RISC中，使有义链被降解17，18，促进导的反义链的准确
7、的载荷。此外，*些核苷酸的GC含量和位置的喜好也影响siRNA的疗效。最正确的siRNA设计的多面性，引导读者到其它文献的主题19，20。使用改进的稳定性和特异性，并减少免疫刺激性质21的经修饰的碱基的siRNA可通过化学合成。一旦进入细胞的胞摄取和逃生或通过电的siRNAs从事Dicer酶-RISC阶段图1的RNAi途径。此外，siRNAs的可以表达为根底的系统纳入序列嵌入到设计模仿初级的miRNA人造的miRNA或前体miRNA短发夹RNA的shRNA22，23的茎环构造。这些RNA干扰触发器可以集成到各种表达系统的shRNA经典的转录聚合酶III启动子如U6和H1，提供严格的控制开场和停
8、顿人工miRNA的转录位点，而更适合基于聚合酶II-系统，它使组织特异性表达策略24。基于这些发夹RNA干扰基板表达，通过RNAi途径处理，从而释放他们的siRNA序列。基于表达式的RNAi载体得起独特的基于病毒的输送系统，稳定的长期抑制基因和更好地控制时空沉默就业时机，其中与转基因方法等相关优势。迄今为止，非病毒和病毒的方法已被成功地到达RNAi介导的基因沉默在多种组织中，包括脑和脊髓。对于治疗的开展，很大程度上取决于交付方式有针对性的组织或细胞的人口和所需的时间间隔沉默。可以通过直接实质注射25合成的siRNA的局灶性交纳。此方法只限于小分子RNA的能力，扩散和渗透整个组织的靶细胞。此外，
9、基因沉默的持续时间是有限的相对短的半衰期的siRNA，慢性击倒需要重复注射或留置续的或脉冲的输液装置。另外，长期的抑制基因的一个单一的设计，以表达茎环构造的RNA26，27的病毒注射后，是可以实现的。至于与非病毒性的战略，组织和转导靶细胞病毒扩散的能力同样限制了他们的RNAi的交付能力28。慢病毒，能够整合到基因组中，针对增殖细胞时是有利的，因此，治疗性基因的表达可以通过细胞分裂维持，如果需要的话。与此相反，腺相关病毒自动增值效劳可能是优选的，针对非分裂细胞如神经元。自动增值效劳通常不整合，而是，游离基因仍然存在，因此，不易发生在宿主基因组中29之引起的插入突变。陪同的文章在这个问题上的基因治
10、疗中进一步讨论了基于病毒传递系统。随着各种RNAi的触发器和交付可供选择，研究人员必须决定哪个组合将产生一个适宜的抑制RNA剂量，以实现强有力的和具体的沉默，在他们的实验设置。考虑到潜在的RNAi治疗诱导细胞毒性剂量优化仍然是一个重要的考虑因素。高水平的外生供给的RNAi基板，可能会干扰细胞功能的饱和RNAi机制，从而破坏天然miRNA介导的基因调控30-32。此外，人工抑制RNA的结合并调节意想不到的靶mRNA，称为脱靶基因沉默33的效果的潜力。关目标，主要发生在种子区域2-8个核苷酸的siRNA对意外的mRNA的3-UTR序列和指导平移镇压和不稳定的那些成绩单，类似的规基于miRNA的沉默
11、机制34 。总之，这些潜在副作用，可能产生严重的后果，例如，格林等人。30报告，高层次的shRNA表达，典型强聚合酶III发起人，在小鼠肝引起的病死率。随后的工作说明，从我们的实验室人工miRNA可能具有较低的毒性潜力。在比较研究中，我们发现的shRNA是更有效的，但在体外和在体诱导毒性，而人工miRNA的表达在容忍的围较低的水平，同时保持强有力的基因沉默的能力32，35。总之，这些结果强调有必要考虑和监测RNAi实验的剂量。合成的siRNA的剂量是相当简单的。然而，最终抑制RNA水平表达为根底的系统，取决于许多因素例如，载体平台，交付方式，选择启动子，发夹构造的RNAi途径组件的可用性，这很
12、可能是唯一的每个实验设置。然而，科学家工具箱提供了一个广泛的RNAi的手段来确定适宜的组合来追求他们的研究目标。转到：沉默中枢神经系统疾病对于主机的神经退行性疾病如阿尔茨海默氏症AD，帕金森PD和多聚谷氨酰胺多聚谷氨酰胺重复疾病，错误折叠的蛋白质出现异常积累中发挥核心作用，在疾病的发生和开展36。因此，神经毒性蛋白质的水平适度减少，预计将提供显着的治疗救灾。利用RNAi为根底的方法，调查人员已经成功地抑制疾病的表达，造成蛋白质在细胞和动物模型的神经退行性疾病，在很多情况下，改善神经病理学和行为的表型。阿耳茨海默氏病AD最常见的神经退行性疾病和全球性痴呆的一个首要原因，AD，其特征在于由大脑的3
13、7的淀粉样蛋白斑和神经原纤维缠结NFTs的的存在下。淀粉样蛋白斑是由错误折叠的A肽，它是由淀粉样前体蛋白APP的蛋白水解加工。RNA干扰策略已经用于通过瞄准的APP的蛋白水解加工所需的酶的表达例如，BACE1，或通过直接针对APP的表达38，39，以减少A肽在体。在每一种情况下，具有改进的神经病理学和存储器有关的表型相关的A肽水平的明显减少。其他AD的病理特征，NFTs的，是由过度磷酸化的头AD4140，另一种治疗的目标。头不出现哺乳动物的脑功能是必不可少的，并在许多神经变性疾病42被牵连。值得注意的是，tau蛋白的基因敲除小鼠抗人A诱导的脑功能障碍43，44。虽然没有研究直接针对头表达的小鼠
14、模型中的AD，彼德拉伊塔等。41最近阻止生产NFTS三重转基因AD小鼠沉默细胞周期蛋白依赖性激酶5CDK5，这是需要tau蛋白磷酸化。因此，本研究验证CDK5的，间接的，可行的RNAi目标AD头。帕金森氏病PD的PD是第二个最常见的神经退行性疾病，病人的大脑往往充满着路易体，主要包括-突触核蛋白-SYN45，46的蛋白质聚集。有趣的是，在- 顺式，以及基因的重复或三次重复的-syn型基因SA的单点突变与遗传性帕金森病47。这些数据导致调查针对-Syn的表达，RNA干扰作为一个合理的治疗帕金森病的方法48-50。至目前为止，研究已经取得了相互矛盾的结果，关于这一战略的有效性和耐受性，与黑质纹状体
15、变性后大鼠脑消耗-Syn的水平51至少有一组报告。这是否是一个模型或特定序列的效果仍是未知。同时，作为遗传研究发现额外公认的治疗目标即富含亮氨酸重 复激酶2，RNA干扰的方法可以用来验证它们在遗传和零星的PD模型。多聚谷氨酰胺重复疾病的家庭的多聚谷氨酰胺重复疾病的家庭由9显性遗传的单基因遗传性疾病：亨廷顿氏病HD，齿状pallidoluysian萎缩，脊髓延髓肌肉萎缩和6的脊髓小脑性共济失调SCA1-3，6，7和1752审阅-55。在每一种情况下，否则不相关的基因在其编码区扩增的CAG三核苷酸重复伸展海港表达后产生突变蛋白包含一个扩展的多聚谷氨酰胺舒展。多聚谷氨酰胺扩展增益功能赋予了有毒各自的突变多聚谷氨酰胺的蛋白质，随着时间的推移肆虐 不同的神经元群体，致命地破坏了许多重要的细胞通路。polyQ蛋白介导的发病确实切机制尚不清楚，但是，对于每一个障碍，polyQ蛋白膨胀突变蛋白的表达驱动疾病的表现，从而使他们明显的单基因沉默为根底的治疗目标。因此，这个家族一直神经退行性疾病的在RNAi治疗开展的前沿，针对中枢神经系统，并鼓励概念证明的结果已被观察到的几个实例。鉴于这类研究已广泛评论别处56，57，在这里我们着重突出一些最新进展。2004年，夏等人。
