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1、.HLA分型技术回顾（1）主要组织相容性复合物（MHC）是脊椎动物体内最复杂且具有高度多态性的基因群。1984年GeorgeSnell首次发现小鼠MHC即H2，1958年Dausset发现了人的MHC即HLA基因。MHC的表达产物称为主要组织相容性抗原，MHC抗原是有核细胞表面膜蛋白分子，对抗原递呈和免疫信号传递起关键作用。HLA基因，位于6号染色体上短臂上，长约4000Kb。HLA是目前所知人体最复杂的遗传多态性系统，有几十个基因座位，每个基因座位又有几十个等位基因，且呈共显性表达。由于MHC基因位于同一条染色体上，其多基因座位上的基因型组合相对稳定，很少发生同源染色体间交换，这就构成了以单
2、元型（HAPLOTYPE，即在同一条染色体上紧密连锁的一系列等位基因的特殊组合）为特征的遗传。按中国人常见的A座位基因有13个，B座位基因有30个计算，可组成的单元型约有1330390种之多。理论上估计，父母各给一串单元型给子女，便会形成4.3万种HLAAB血型。事实上，HLA各基因并非完全随机地组成单元型，而是呈现出连锁不平衡（linkagedisequilibrium,LD）的特点。理论推测的HLA分型数量巨大，但对一个具体的民族来说并非如此。世界上各个民族人群的HLA多态性和单元型都有各自的特点。总体来讲，中国北方汉族、北美白人和北美黑人人群的多态性较中国南方汉族和日本人群丰富。即使在中
3、国，地区间也存在差异。在中国汉族群体中抗原A1、A3、B13、B44和B51频率呈北高南低分布，而抗原A24、B46、B60呈北低南高分布。在中国汉族群体中常见的A30-B13-DRB1*07，A1-B37-DRB1*10单体型频率呈北高南低分布，在江浙沪汉族人群中频率较北方汉族人群下降，而A2-B46-DRB1*09，A33-B58-DRB1*17，A33-B58-DRB1*13单体型频率呈北低南高分布。HLA多态性程度可见一斑。HLA研究涉及免疫学、生物学、遗传学、分子生物学、医学等多个学科，并已发展成为一个独立的学科分支。迄今HLA研究已达到相当深入的水平，并在诸多方面取得显著进展，包括
4、HLA复合体结构；HLA分子结构及其表达的调控；HLA分子功能，尤其是在抗原处理、呈递及T细胞识别中的作用；HLA的DNA分型及多态性研究；HLA与疾病的关系；HLA与移植的关系等。HLA研究不仅使器官移植成为一种极有价值的治疗手段，并给基础与临床免疫带来了突破性进展。已经证实，HLA复合体中存在控制免疫应答的基因以及HLA参与约束免疫细胞间相互作用，这表示HLA涉及生命活动的各个水平与多个方面。可以预期，对HLA的研究将继续成为免疫遗传学最活跃的部分；对HLA的应用将扩展到基础、临床、预防医学的各个领域。纵观HLA系统的研究过程，其发展无不与技术的手段的突破与运用有密切关系。70年代到80年
5、代末期主要是血清学研究；90年代以来，HLA进入了分子水平研究阶段，进展尤为显著。HLA分型技术同样走过了这一历程。建立于60年代并不断完善的血清学及细胞学分型技术主要侧重于分析HLA产物特异性。血清学分型借助的是微量淋巴细胞毒试验（microlymphocytotoxicitytest）或称补体依赖的细胞毒试验（complementdependentcytotoxicitytest，CDC）。取已知HLA抗血清加入待测外周血淋巴细胞，作用后加入兔补体，充分作用后加入染料，着染的细胞为死亡细胞，依据特异性抗体介导的补体系统对靶细胞溶解的原理，待检淋巴细胞表面具有已知抗血清所针对的抗原。血清学分
6、型存在诸多缺点：标准分型抗体亲和力较弱、效价较低、易产生交叉反应，缺少某些单价抗血清；某些病理过程可能导致外周血淋巴细胞表面抗原性质发生改变干扰抗原抗体反应；国内供HLAI类抗原分型的血清板来源困难、质量欠佳。上述因素均严重影响了HLA分型结果的可靠性及该技术的推广应用。细胞学分型技术指的是通过纯合分型细胞（homozygotetypingcell,HTC）及预致敏淋巴细胞试验（primedlymphocytetest,PLT）对HLA分型。二种方法的基本原理均是判断淋巴细胞在识别非己HLA抗原决定簇后发生的增殖反应。由于分型细胞来源困难以及操作手续繁琐，细胞学分型技术下正逐渐淘汰。1991年
7、第11届国际HLA专题讨论上提出了HLA的DNA分型方法，这类方法近年来在研究和应用方面发展非常快，有取代其他方法的趋势。DNA分型方法主要分为两种：基于核酸序列识别的方法和基于序列分子构型的方法。下面简要的阐述各方法的原理和优缺点。基于核酸序列识别的方法主要有：PCR-RFLP，PCR-SSO，PCR-SSP和PCR-SBT。PCR-RFLP：CAPs(cleavedamplificationpolymorphismsequence-taggedsites)CAPs技术又称为PCR-RFLP，限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）技术。其原理是将目的基因片段PCR扩增后，利用多
8、种限制性内切酶对扩增产物进行酶切，不同的基因序列会产生不同的酶切产物，从而产生不同的电泳图谱。它以其简单、敏感、准确，无需同位素等优点成为目前较常用的HLA基因分型技术之一，但是无法分辨杂合子，且只能区分有限的多态性。PCR-RFLP的基本原理是用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的DNA片段条带。此项技术大大提高了目的DNA的含量和相对特异性，而且方法简便，分型时间短。基本流程1.根据基因名称查询序列，设计引物。2.提取基因组DNA。3.PCR扩增。4.产物酶切，凝胶电泳。PCR-SS
9、O（sequencespecificoligonucleotide）：也称顺序特异寡核苷酸法原理是PCR基因片段扩增后利用序列特异性寡核苷酸探针，通过杂交的方法进行扩增片段的分析鉴定。探针与PCR产物在一定条件下杂交具有高度的特异性，严格遵循碱基互补的原则。探针可用放射性同位素标记，通过放射自显影的方法检测，也可以用非放射性标记如地高辛、生物素、过氧化物酶等进行相应的标记物检测。用以同位素或非放射性标记的探针与PCR扩增的目标片断产物杂交，根据阳性斑点判断个体基因型。由于HLA等位基因非常多，就需要很多的探针对每个DNA样品要进行多次杂交（甚至十几次）才能完成定型分析操作也十分繁琐。于是在此基
10、础上又发展起来一种反向杂交法（reversehybridization）。将各种不同的探针固定于同一张膜上，再将PCR产物标记，以PCR产物（待检测基因DNA）反过来与探针杂交。这样一次杂交即可完成多个等位基因分析。此方法具有灵敏度、特异性强、需样本量少等优点，但不同探针的杂交条件的须严格统一（如温度，离子强度）,易出现误差;不能检测新等位基因，试剂盒需不断升级;对某些杂合子分辨率也不好;。很多HLA基因型含有相同的多态性，而仅仅由于排列方式不同，因此分辨率不及SSP和SBT（4.01113）。此方法适宜大量和高纯度样本，杂交条带将作为书面原始记录长期保存（三种效果比较）。PCR-ASO探针法
11、（PCR-allelespecificoligonucleotide,ASO）：即等位基因特异性寡核苷酸探针法。在PCR扩增DNA片段后，直接与相应的寡核苷酸探针杂交，即可明确诊断是否有突变及突变是纯合子还是杂合子。其原理是：用PCR扩增后，产物进行斑点杂交或狭缝杂交，针对每种突变分别合成一对寡核苷酸片段作为探针，其中一个具有正常序列，另一个则具有突变碱基。突变碱基及对应的正常碱基匀位于寡核苷酸片段的中央，严格控制杂交及洗脱条件，使只有与探针序列完全互补的等位基因片段才显示杂交信号，而与探针中央碱基不同的等位基因片段不显示杂交信号，如果正常和突变探针都可杂交，说明突变基因是杂合子，如只有突变探
12、针可以杂交，说明突变基因为纯合子，若不能与含有突变序列的寡核苷探针杂交，但能与相应的正常的寡核苷探针杂交，则表示受检者不存在这种突变基因。若与已知的突变基因的寡核苷探针匀不能杂交，提示可能为一种新的突变类型。PCR-SSP：序列特异性引物分析即根据各等位基因的核苷酸序列，设计出一套针对每一等位基因特异性的（allele-specific）、或组特异性(group-specific)的引物，此即为序列特异性引物（SSP）。SSP只能与某一等位基因特异性片段的碱基序列互补性结合，通过PCR特异性地扩增该基因片段，从而达到分析基因多态性的目的。上述的PCR/RFLP、PCR/SSO等，最终均需用标记
13、的特性探针与扩增产物进行杂交，再分析结果。PCR/SSP方法用乃设计出一整套等位基因组特异性引物（sequencespecificprimer,SSP），借助PCR技术获得HLA型别特异的扩增产物，可通过电泳直接分析带型决定HLA型别，从而大大简化了实验步骤。优点是简单易行,分辨率可从低到高,成本低。缺点是不易自动化;不能检测新的等位基因，试剂盒需不断升级。此方法适宜零散和纯度低样本，重复实验时要重提DNA和必须使用紫外凝胶成象仪保留原始资料，增加实验成本（三种效果比较）。PCR-SSP和PCR-SSO均需大量试剂（引物）,且不能识别非经典的HLA基因和假基因（绿）。针对HLA外显子和内含子序
14、列精心设计引物可避免这些问题。PCR-SBT:以PCR扩增所要分析的基因片断，然后对DNA序列进行分析，可以直接得到基因型。分辨率高，可大规模进行，精确度高，能直接发现新的等位基因。但是由于杂合子的存在，无法分辨单元型。以上各个方法都存在无法克服的缺陷，如能配合使用，则能大大提高分型能力。国外有学者对60个样本进行研究，发现单用SBT，只有18的样本能将A，B位点同时分型成功，如结合SSO，则能将所有样本成功分型。基于核酸序列识别的分型方法始终无法越过杂合子的难关。HSE(Haplotype-specificextention)技术完美地解决了这一问题。它是利用磁珠与其中一条同源染色体的特异位
15、点结合，达到分离同源染色体的目的，杂合子问题不攻自破。因此，HSE无论与SSO还是SBT结合使用，都有极好的效果（1.0112，4.0194）。近年来，测序新技术发展层出不穷，纷纷运用到HLA分型中。如MSNE(multiplexsinglenucleaotideextention),应用链中止法原理，根据等位基因SNP位点设计特异性引物和生物素荧光标记的ddNTP进行分型，有重复性好，可分辨杂合子等优点，已应用到A位点的分型中。（4.0193）又如pyrosequencing法分型，分辨率好，可分辨杂合子，自动化程度也高。DNA芯片技术，作为一项检测SNP的成熟技术，也已应用到HLA分型中.
16、基于序列分子构型的分型方法在理论上就避开了杂合子这个难题。SSCP(PCR单链构象多态性分析，PCR-singlestrandconformationalpolymorphism)是最常用的根据构型的分型方法。扩增的目标产物变形后形成单链，不同的序列，甚至仅有一个碱基的差异，就会形成不同的茎环结构，从而电泳速率不同。但此方法仅限于分辨仅限于200300bp（绿16），且即使是同一单链DNA在相同情况下也会形成不同的构型，使得电泳条带很难分析;也有可能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小的情况,使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检。HA(异源二聚体电泳多态性，HeteroduplexAnalysis)是另一种基于序列分子构型的分型方法，根据异源二聚体未配对区域的长度和分布而显示出电泳
