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1、细心整理荧光定量PCR原理及运用荧光定量PCR(FQ-PCR)是新近出现一种定量PCR检测方法。其根本特点是：1、用产生荧光信号指示剂显示扩增产物量。2、荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或双重标记序列特异性荧光探针或能量信号转移探针等方法获得，大大提高了检测灵敏度、特异性和精确性。3、动态实时连续荧光检测，免除了标本和产物污染，且无困难产物后续处理过程，高效、快速。下面介绍常用几种检测方法：1、 双链DNA内插染料某些染料如SYBR Green 能选择性地及双链DNA结合，同时产生猛烈荧光。在PCR过程中SYBR Green 可及新合成双链DNA结合，产生荧光信号及双链DNA成正比。SYB
2、R Green I荧光染料技术原理SYBR Green I是一种只及DNA双链结合荧光染料。当它及DNA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子数量。SYBR Green荧光染料法定量PCR根本过程是：1、起先反响，当SYBR Green染料及DNA双链结合时发出荧光。2、DNA变性时，SYBR Green染料释放出来，荧光急剧削减。3、在聚合延长过程中，引物退火并形成PCR产物。4、聚合完成后，SYBR Green染料及双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光净增量加大。SYBR Green I荧光染料及DNA双链结合
3、SYBR Green I荧光染料能及全部DNA双链相结合，对DNA模板没有选择性，所以特异性不如TaqMan探针。要想用荧光染料法得到比拟好定量结果，对PCR引物设计特异性和PCR反响质量要求就比拟高。在此前提下，本法是一种本钱低廉选择。2、 TaqMan探针技术原理TaqMan探针法是高度特异定量PCR技术，其核心是利用Taq酶35外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针及模板是特异性结合，所以荧光信号强弱就代表了模板数量。在TaqMan探针法定量PCR反响体系中，包括一对PCR引物和一条探针。探针只及模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针5端标记有报告基团(Reporte
4、r, R)，如FAM、VIC等，3端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA等。当探针完整时候，报告基团所放射荧光能量被淬灭基团吸取，仪器检测不到信号。随着PCR进展，Taq酶在链延长过程中遇到及模板结合探针，其53外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸取，即产生荧光信号。所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目片段一样，有一个同步指数增长过程。信号强度就代表了模板DNA拷贝数。5，TaqMan探针荧光信号产朝气制依据其3端标记荧光淬灭基团不同分为两种：平凡TaqMan探针和TaqMan MGB探针。MGB探针淬灭基团接受非荧光淬灭基团(Non-
5、Fluorescent Quencher)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号强度。同时探针上还连接有MGB (Minor Groove Binder)修饰基团，可以将探针Tm值提高10C左右。因此为了获得同样Tm值，MGB探针可以比平凡TaqMan探针设计得更短，既降低了合成本钱，也使得探针设计成功率大为提高。因为在模板DNA碱基组成不志向状况下，短探针比长更简洁设计。试验证明，TaqMan MGB探针对于富含A/T模板可以区分得更为志向。 TaqMan MGB探针探针设计一般应符合以下条件：1、探针长度应在2040个碱基左右，以保证结合特异性。2、G、C碱基含量在40-60，幸免单核苷酸
6、序列重复。3、幸免及引物发生杂交或重叠。4、探针及模板结合稳定程度要大于引物及模板结合稳定程度，因此探针Tm值要比引物Tm值至少高出5。3、 分子信标技术分子信标技术molecular beacon也是在同一探针两末端分别标记荧光分子和淬灭分子，及TaqMan探针不同是该探针5和3末端自身可形成一个8个碱基左右发卡构造，此时荧光分子和淬灭分子邻近，因此不会产生荧光。当溶液中有特异模板时，该探针及模板杂交，从而破坏了探针发卡构造即FRET消逝，于是溶液便产生荧光，荧光强度及溶液中模板量成正比，因此可用于PCR定量分析。 Ct 值含义是:每个反响管内荧光信号到达设定域值时所阅历循环数。探究说明 ,
7、每个模板 Ct 值及该模板起始拷贝数对数存在线性关系 ,起始拷贝数越多 ,Ct值越小。利用确定起始拷贝数标准品可作出标准曲线 ,因此只要获得未知样品 Ct 值 ,即可从标准曲线上计算出该样品起始拷贝数。1、双链DNA内插染料 常用是SYBR Green I荧光染料，其技术原理：SYBR Green I是一种只及DNA双链结合荧光染料。当它及DNA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子数量。SYBR Green荧光染料法定量PCR根本过程是：1、起先反响，当SYBR Green染料及DNA双链结合时发出荧光。2、DNA
8、变性时，SYBR Green染料释放出来，荧光急剧削减。3、在聚合延长过程中，引物退火并形成PCR产物。4、聚合完成后，SYBR Green染料及双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光净增量加大。荧光染料检测法一般主要是利用荧光染料(如SYBR Green I)及双链DNA分子结合发光特性来指示扩增产物增加，优点是：无需另外设计荧光探针，无需特别优化条件，简便易行，本钱较低，能适用于任何一款定量PCR仪。荧光染料法实质上是常规PCR反响中添加了荧光染料，借助染料和双链DNA结合所发出荧光实时监控反响进程。由于不须要设计序列特异性探针和优化反响条件，价格低廉，通用性强，而且荧光染料法可用于任何一
9、种型号定量PCR仪，因而同样得到广泛接受。在PCR反响体系中，参与过量SYBR Green I荧光染料，SYBR荧光染料掺入DNA双链后荧光信号显著增加；当DNA变性时SYBR Green I染料释放出来，荧光急剧削减；随后在聚合延长过程中引物退火并形成PCR产物，SYBR Green染料及双链产物结合，经检测获得荧光净增量。荧光信号增加及PCR产物增加完全同步。荧光染料可以在反响末尾对扩增产物进展溶解，称为溶解曲线分析。在溶解曲线分析过程中，随着温度从低于产物溶解点缓慢升到高于产物溶解点，定量PCR仪连续监测每个样品荧光值。基于产物长度和G/C含量不同，扩增产物会在不同温度点解链。随着产物解
10、链就可以看到荧光值降低并被仪器所测量。对溶解曲线进展微分可以计算出溶解峰。溶解峰可以反映反响中扩增到产物，因此用溶解曲线数据就可以进展定量检测了。将强毒株H2RNA模板做10倍倍比稀释后，用紫外分光光度计测定其浓度，然后按下面公式转换成模板拷贝数：拷贝数=NDV模板浓度阿氏常数(一个碱基平均分子量NDV模板总长度)其中，阿氏常数为6.021023，一个碱基平均分子量为324.5，NDV模板总长度为15 186 bp，标准品RNA模板分别进展101 、102 、103 、104、105、106、107稀释后，用紫外分光光度计测定病毒RNA模板OD值，分别计算其浓度，用于制作标准曲线，同时做一个阴性参照。
