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1、鸡肝过氧化氢酶的提取、分离和纯化孙文刚 云南民族大学化学与生物技术学院 云南 昆明 摘要： 新鲜鸡肝经匀浆、磷酸缓冲溶液抽提、硫酸铵分级沉淀、 DEAE Sepharose离子交换层析、Sepharcyl S -200凝胶过滤层析、得到鸡肝过氧化 氢酶电泳纯制品。回收率为18.23%，比活达4780.38U/mg，纯化倍数为66.15, 最适温度为40C，最适PH为7.0。该酶在2040C, PH 58内稳定。经凝胶 过滤和SDS-PAGE测得该酶的全分子量为250KD,亚基分子量为62.5KD。关键词： 家鸡；肝脏；过氧化氢酶；分离纯化；性质Chicken liver Catalase of
2、 Extraction, Separation and PurificationWengang SunYunnan Minzu UniversityAbstract: A catalase was purified from Anas Chicken homogenation ,n- butanol disposal, ammo-nium sulfate precipitation, ion-exchange chromatography on DEAE-Sepharose Fast Flow column and gelfiltration chromatography on Sephacr
3、yl S-200.The purity of the purified catalase was confirmed by thepresence of a single band on SDS-PAGE.18.23% of the catalase activity was recovered. The specific activ-ity was 4 780.38 U/mg. The optimum pH and optimum temperature were 7.0 and 40C ,respectively. The catalase appeared to be stable at
4、 2040Cand pH 5 8,and it was 66.15-fold purified. Sephacryl S-200 chromatography and SDS-PAGE showed that the molecular weight of this catalase was 250 KD and itssubunit was about 62.5 KD.Key words: Anas Chicken; liver; catalase; purification; property引言过氧化氢酶（Catalase,EC1.11.1.6，简称CAT）是一类广泛存在于动物、植 物和
5、微生物体内的末端氧化酶，酶分子结构中含有铁卟啉环,1 个酶蛋白分子中 含有 4 个铁原子1。过氧化氢酶是在生物演化过程中建立起来的生物防御系统 的关键酶之一2，催化细胞内过氧化氢的分解。过氧化氢酶已成为农业及相关 食品业、乳制品业、造纸业以及农业环保业中有价值的酶之一。 CAT 主要以与 细胞器，如线粒体、过氧化物酶体结合的形式存在, 而在红细胞中则以可溶状态 存在。过氧化氢酶几乎普遍存在于所有能呼吸的生物体内，在哺乳动物的肝与红 细胞中含量较高，国内外学者多从动物肝中提取 1,3-6, 也有从血液、胎盘、贻贝、苹果以及微生物中提取的研究7-13。但从鸡肝中分离纯化过氧化氢酶的研究未见 报道。
6、为此，本文尝试从鸡肝中分离纯化过氧化氢酶并研究其相关的酶学特性。1. 材料与方法1.1 实验材料家鸡肝脏取自健康活鸡,杀死后立即取肝脏于冰箱中冰冻保存备用14。1.2 实验仪器 紫外分光光度计、冷冻离心机、超声波破碎仪、可见分光光度计、离子交 换柱、SDS-PAGE电泳装置、冰箱、酶标仪等。13 实验试剂Tris 试剂、甘油、 KCl、 HCl 、硫酸铵、牛血清蛋白、磷酸缓冲液、考马 斯亮蓝G-250、95%乙醇、钼酸铵、过氧化氢、30%丙烯酰胺凝胶贮存液、SDS 聚丙烯酰胺等。2实验方法2.1 粗酶液的制备称取新鲜鸡肝100g，用自来水洗净，再用消毒双蒸水漂洗干净。按1：5(M： V)的比例
7、加入预冷的0.05mol/L的磷酸缓冲液(pH7.2),用高速组织捣碎机捣碎， 置于4C冰箱抽提2h；离心(6000r/min,4C,30min),收集上清液；加入硫酸铵 至40%饱和度，离心(6000r/min,4C,30min)去沉淀，上清中再加硫酸铵至60%饱 和度，离心收集沉淀；将沉淀重溶于0.05 mol/L的磷酸缓冲液(pH 7.2)中,4C 透析夜，然后按1 ： 1(V ： V)的比例向透析液中加入预冷的正丁醇进行脱脂,4C 静置过夜然后6000r/min离心，弃去沉淀以及正丁醇层，重复2次，得粗酶液。2.2 DEAE-Sepharose 离子交换层析DEAE-Sepharose
8、 离子交换层析柱为通用安玛西亚公司生产的 DEAE Sepharose Fast Flow 5mL预装柱，用磷酸缓冲液(0.05mol/L,pH7.2)平衡至少4倍柱体积 (20mL),上样 5mL。用 01mol/L NaCl 溶液(含 0.05 mol/L,pH7.2 的磷酸缓冲 液)进行梯度洗脱，流速30mL/h,每管收集5mL,紫外监测波长为280nm ;测定各管 过氧化氢酶活性和蛋白含量；收集活性较高的各管酶液,4C透析过夜，冷冻干燥 后进行凝胶过滤。2.3 SephacrylS-200 凝胶过滤柱层析SephacrylS-200凝胶柱按产品说明书要求处理，装柱(16mmX 835m
9、m)后，用 磷酸缓冲液(0.05mol/L,pH7.2)冲洗一定体积，上样2mL。用磷酸缓冲液(0.05mol/L,pH7.2）进行洗脱，流速18mL/h,每管收集3mL；测定每管过氧化氢酶活性 和蛋白含量；收集活性较高的各管酶液，4C透析、冷冻干燥,得到过氧化氢酶纯 品。2.4 过氧化氢酶活性测定以过氧化氢为底物, 采用钼酸铵终止法15:取 0.16 mol/L 的过氧化氢溶液 0.2mL,加入1.29mL磷酸缓冲液（0.05mol/L,pH7.2）中,37 C温浴5min,再加入 0.01mL 过氧化氢酶液, 立即混匀并计时 1min, 然后加入 1.5mL 32.4mmol/L 钼酸 铵
10、溶液终止反应,405nm测定其OD值；以先加钼酸铵，再加酶液的为对照.过氧 化氢酶活性单位定义为:每分钟分解l“mol过氧化氢所需的酶量为一个酶活力 单位。2.5 蛋白质含量测定按Lowry法址和分光光度法卫进行测定，以牛血清白蛋白为标准样品。2.6 蛋白质分子量测定用凝胶过滤18和SDS-PAGE测量其全分子量和亚基分子量,SDS-PAGE的分离 胶浓度为12%,电泳后用考马斯亮蓝R-250染色。2.7 最适 pH 及 pH 稳定性37C下,分别测定过氧化氢酶在不同pH（312）口9缓冲液下的酶活性以及4C 放置 48 h 后的酶活性。2.8 最适温度及热稳定性分别测定过氧化氢酶在不同温度（
11、2570C） 20下的酶活性，以及在上述不同 温度下分别保温10,30,60min后酶的活力。2.9 反应初速度 V 的测定0在最适条件下, 在 12 min 内, 每隔 20s 测定一次过氧化氢酶活性, 以时间 为横坐标,以底物浓度的减少量为纵坐标作图,得一直线,其斜率即是酶促反应的 初速度 V 21。02.10酶Km值及Vm的测定在最适条件下,以不同浓度的过氧化氢为底物,测定其酶活性,并按双倒数 法（Lineweaver-Burk法）作图】22,求出Km以及Vmax,底物浓度范围设置为4.7 37.5mmol/L。2.11 金属离子对酶活性的影响在测活体系中加入不同的金属离子,使金属离子的
12、终浓度达到 1 mmol/L,4C 放置48h后,37C下测定活性，以不加金属离子的酶活力为100%.金属离子分别 为：Pb2+,Ba2+,Cu2+,As3+,Mg2+,Mn2+,K+,Cr3+,Ag+,Fe2+。2.12 化学试剂对酶活性的影响在体系中分别加入不同浓度的化学试剂EDTA、抗坏血酸、尿素，4C放置 48h后,37C下测定活性，以不加化学试剂的酶活力为100%。3. 结果与分析3.1 鸭肝过氧化氢酶的分离纯化粗酶液经 DEAE-Sepharose 离子交换层析柱后, 所得结果如（图 1）所示, 收集 有活性的各管洗脱液，经透析、浓缩后,再经过Sephacryl S-200凝胶柱，
13、所得结 果如（图2）所示.纯化后的过氧化氢酶经SDS-PAGE,显示为一条带（图3）,说明该 酶纯化已经达到电泳纯， 酶的整个分离纯化结果见表 1.OOOOOOOOOO)9876543211TOD280204060管数US活酶氢化氧过图 2. 鸡肝过氧化氢酶的 Sephacryl S-200 凝胶柱层析&M.分子标准样品marker； 1.鸡蛋清溶菌酶14.4KD； 2胰蛋白酶抑制剂20.1KD；3.牛碳酸酐酶 31KD； 4.兔肌动蛋白 43KD； 5.牛血清蛋白 66.2KD； 6.兔磷酸化 酶B 97.4KD； S.过氧化氢酶步骤总蛋白质 /mg总活力/U比活 /(U/mg)回收率/%纯
14、化倍数样品液30908.002233710.0072.27100.001.00粗酶液4158.801833450.40440.8682.086.10离子交换层析DEAE- sepharose280.01565809.992020.6825.3327.96Sephacryl 凝胶 层析85.21407320.104780.3818.2366. 15表 1. 鸡肝过氧化氢酶的分离纯化3.2 鸡肝过氧化氢酶分子量测定SephacrylS-200 凝胶层析测得鸭肝过氧化氢酶的全分子量为 250KD,SDS- PAGE法测定其多肽链分子量为62.5KD，表明鸭肝过氧化氢酶由4条相同的多肽 链组成。3.3
15、过氧化氢酶的最适pH与pH稳定性实验结果表明，鸡肝过氧化氢酶在pH 7.0左右时活性最强,pH 5.07.5活 力较高，超出其范围活力较低（图4）。鸡肝过氧化氢酶在pH 38的范围内是比 较稳定的，在pH 58的范围内活性基本保留原有活性的90%以上,pH 9.0时,残 余酶活力不到60%（图 5）。為活酶对相1015PH為活酶对相148642OPH图 5. 鸡肝过氧化氢酶的 PH 稳定性3.4 过氧化氢酶的最适温度与热稳定性实验结果表明，鸡肝过氧化氢酶的最适温度为40C左右（图6）,2040C具 有较好的热稳定性，保温60min活性保留原有活性的90%以上。该酶60C保温 60min活性丧失50%以上,65C保温10min活性损失殆尽（图7）。為活酶对相20406080图 6.温度对鸡肝过氧化氢酶活力的影响O12100易活酶对相80604020保温10min保温30min保温 60min20406080温度图 7. 鸡肝过氧化氢酶温度稳定性3
