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1、腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目 录第一章 简介 1其次章 应用重组腺病毒的优点 2第三章 AdEasyTM 技术 33.1 技术概况 33.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3第四章 主要流程 44.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 4 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体 54.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生 5 4.2.1 共转化的一般原则 5 4.2.2 共转化方法 5 4.2.3 预期结果 54.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 64.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A细胞
2、6 4.4.1 细胞铺板 6 4.4.2 磷酸钙转化技术 7第五章 常用技术 85.1 QBI-293A细胞培育 8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培育 8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培育和增殖 8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存 85.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生 9 5.2.1 感染QBI-293A细胞 9 5.2.2 病毒空斑形成 9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 95.3 MOI测定 105.4 腺病毒感染力测定 10 5.4.1 X-Gal染色 115.5 重组腺病毒的筛选和纯化 11 5.5.1 选择最佳重组腺病毒：表达和基因输送
3、11 5.5.2 病毒空斑选择和小量扩增 12 5.5.3 Western杂交 13 5.5.4 Southern杂交和点杂交 13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14 5.5.6 免疫测定 14 5.5.7 功能测定 145.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增 155.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 16 5.7.1 不连续密度梯度离心 17 5.7.2 连续密度梯度离心 17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集 175.8 病毒滴度测定 18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法 20 5.8.3 50%组织培育感染剂量法 20
4、第六章 疑难解答 226.1 QBI-293A细胞培育 226.2 感染力测定 226.3 转移载体克隆 236.4 在BJ5183细胞中共转化和重组 246.5 转染QBI-293A细胞 256.6 筛选和测定 256.7 在QBI-293A细胞中表达 266.8 重组腺病毒的扩增 266.9 纯化 266.10 病毒滴度测定 27缩写 英文全称 中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素-Gal -Galactosidase -半乳
5、糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNAcccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNACPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbeccos Modified Eagle Medium DMEM培育基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacet
6、ic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培育基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Mess
7、enger RNA 信使RNAMWCO MOIecular Weight Cut-off PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠
8、TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培育感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷第一章 简 介当今基因输送技术的发展日趋困难，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成须
9、要更高效的基因输送工具。人类基因组支配和正不断发展的基因治疗同样急需发展快速有效和治疗性的分析工具。为解决这一问题，基因输送技术(通常运用病毒载体如增殖缺陷的腺病毒)通过基因工程不断发展，致力于生产基因表型药物。重组腺病毒供应了一类在基因转移系统发展中有极大潜力的新的生物治疗剂。1953年对一般感冒病因的探究和探讨导致了腺病毒的发觉。迄今为止已发觉了40多种不同血清型和93种不同种类的腺病毒，它们通常感染眼、呼吸道或胃肠上皮（Fields等，1996）。1977年，Frank Graham博士建立了一种细胞株，可在无协助病毒的状况下产生重组腺病毒（Graham等，1977）。此后，腺病毒载体作
10、为极具潜力的哺乳动物基因转移载体而得到广泛应用，尤其是在基因治疗相关领域。迄今为止已有大量关于腺病毒及其应用的综述发表，我们给感爱好的读者举荐以下文章：Hitt et al，1999和Wivelet al，1999。腺病毒亦可被用来在人体细胞中过量表达蛋白（Massie et al，1998 A, B）。但迄今为止还只有熟知腺病毒的探讨人员才会采纳腺病毒系统。昆腾生物科技公司是第一个供应完备而且能广泛应用的重组腺病毒试剂盒Adeno-QuestTM系统及其相关产品和客户服务的公司，这个系统的基础是在293细胞中产生重组腺病毒。现在介绍的AdEasyTM系统以细菌内重组取代哺乳动物细胞（He e
11、t al，1998），使获得重组腺病毒对任何有细胞培育设备的分子生物试验室都更便利。重组腺病毒事实上可在任何细胞或组织中用来探讨表达重组蛋白。AdEasyTM转移载体可允许插入7.5kb的外源DNA，目前正探讨腺病毒其它区的缺失以提高腺病毒在基因治疗中的应用。这本手册供应了重组腺病毒技术中全部必需遵循的原则，并具体描述了产生一个重组腺病毒的全部试验步骤，包括重组腺病毒在QBI-293A细胞中扩增并纯化到1012VP的操作步骤。AdEasyTM载体系统包含了生产5型重组腺病毒所需的全部试剂，全部成分购买后即可运用。其次章 应用重组腺病毒的优点1. 宿主范围广, 对人致病性低这套腺病毒载体系统可广
12、泛用于人类及非人类蛋白的表达。腺病毒可感染一系列哺乳动物细胞，因此在大多哺乳动物细胞和组织中均可用来表达重组蛋白。2. 在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因逆转录病毒只能感染增殖性细胞，因此DNA转染不能在非增殖细胞中进行，而必需使细胞处于持续培育状态。腺病毒则能感染几乎全部的细胞类型，除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞。腺病毒是探讨原代非增殖细胞基因表达的最佳系统，它可以使转化细胞和原代细胞中得到的结果干脆进行对比。3. 能有效进行增殖，滴度高这套腺病毒系统可产生1010到1011VP/ml，浓缩后可达1013VP/ml，这一特点使它特别适用于基因治疗。4. 无需协助病毒，可容纳7.5 kb外源
13、DNA： 为供应克隆空间，此腺病毒缺失了E1和E3早期区。此外，此腺病毒可包装比正常病毒DNA稍大的DNA分子（105%）。这些特点允许插入腺病毒的基因或多基因表达盒可达7.5kb。5. 与人类基因同源该腺病毒载体系统应用了人类病毒作为载体，以人类细胞作为宿主，因此为人类蛋白进行精确的翻译后加工和适当的折叠供应了一个志向的环境。大多数人类蛋白都可达到高水平表达并且具有完全的功能。6. 不整合到染色体中，无插入致突变性逆转录病毒可随机整合到宿主染色体，导致基因失活或激活癌基因。而腺病毒则除了卵细胞以外几乎在全部已知细胞中都不整合到染色体中，因此不会干扰其它的宿主基因。在卵细胞中整合单拷贝病毒则是
14、产生具有特定特征的转基因动物的一个较好的系统。7. 能在悬浮培育液中扩增： 293细胞可以适应悬浮培育，这一调整可使病毒大量扩增。大量事实证明悬浮293细胞可在120L的生物反应器中表达重组蛋白。8. 能同时表达多个基因这是第一个可以在同一细胞株或组织中用来设计表达多个基因的表达系统。最简洁的方法是将含有两个基因的双表达盒插入腺病毒转移载体中，或者用不同的重组病毒共转染目的细胞株来分别表达一个蛋白。测定不同重组病毒的MOI比值可正确估计各重组蛋白的相对共表达状况。第三章 AdEasyTM技术3.1 技术概览AdEasyTM系统是由T.C.He等（1998）构建的用来代替传统腺病毒重组系统的一个
15、快捷系统。在这个系统中，只需二步即可产生重组腺病毒：先将表达盒装入转移载体，然后再通过同源重组插入腺病毒基因组。将外源基因插入腺病毒的最有效途径是通过同源重组，缘由是：1）腺病毒DNA是大型的线性分子，含有几乎全部的内切酶切位点；2）基因组过大（36kb），难于操作。在AdEasyTM载体系统中，含有大部分腺病毒基因组的载体为超螺旋质粒，而不是线性DNA，同源重组则在大肠杆菌进行。相对于传统系统而言，这二点改进使病毒DNA操作更简洁，同时由于利用了大肠杆菌的高效率同源重组特性而使重组载体的筛选更为简洁。在本系统中，首先将基因cDNA插入一个转移载体，将得到的质粒用PmeI线性化，然后在大肠杆菌BJ5183中与病毒DNA质粒pAdEasy-1进行同源重组。pAdEasy-1缺失了E1和E3区，其E1区功能将在293A细胞中得到互补。重组子通过卡那霉素筛选，用内切酶进行鉴定分析。最终将得到的重组腺病毒用PmeI线性化，暴露其反向末端重复序列（ITR，Iaverted Termined Repeats），转染QBI-293A细胞后产生重组病毒颗粒。同源重组在线性化的转移载体和完整的超螺旋腺病毒质粒之
