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1、GB201x-xx-xx 实施201x-xx-xx发布食品安全国家标准食品中乳铁蛋白的测定（征求意见稿）GB xxxx201x中华人民共和国国家标准食品安全国家标准食品中乳铁蛋白的测定1 范围本标准规定了食品中乳铁蛋白的高效液相色谱测定方法。本标准适用于婴幼儿配方奶粉、婴幼儿配方米粉、调制奶粉、发酵乳、灭菌乳、调制乳、乳酸菌饮品、维生素饮料、奶酪、蛋白质粉等食品中乳铁蛋白含量的测定。2 原理试样中的乳铁蛋白经磷酸盐缓冲液提取,肝素亲和柱净化后,反相高效液相色谱柱分离，二极管阵列检测器检测于280 nm处检测，外标法定量。 3 试剂和材料注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T
2、6682规定的一级水。3.1 乙腈（CH3CN）：色谱纯。3.2 无水乙醇（C2H6O）：色谱纯。3.3 氯化钠（NaCl）。3.4 磷酸（H3PO4）。3.5 磷酸氢二钠（Na2HPO4）。3.6 三氟乙酸（CF3CO2H）。3.7 磷酸氢二钠溶液(0.20 mol/L)：称取28.4 g磷酸氢二钠，加800 mL水溶解，用磷酸调pH至8.000.5，加水定容至1000 mL。3.8 磷酸氢二钠-氯化钠溶液：称取7.10 g磷酸氢二钠，58.4 g氯化钠，加适量水溶解，用磷酸调pH至8.000.5，加水定容至1000 mL。3.9 三氟乙酸溶液(0.1%)：吸取1 mL三氟乙酸，加水定容至1
3、000 mL，过0.45 m滤膜。3.10 乙醇溶液（20%）：量取20 mL无水乙醇，加水定容至100 mL。3.11 乳铁蛋白标准品。3.12 标准溶液的制备3.12.1 乳铁蛋白标准储备溶液（10 mg/mL）：准确称取乳铁蛋白标准品用水溶解，定容至10 mg/mL。置于04冰箱中保存，可保存三个月。3.12.2 乳铁蛋白标准中间溶液（0.5 mg/mL）：准确吸取2.5 mL乳铁蛋白标准储备溶液，用水定容至50 mL。置于04冰箱中保存，可保存两周。3.12.3 乳铁蛋白标准工作溶液：分别准确吸取乳铁蛋白标准中间溶液0.0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL，
4、5.0 mL至10 mL 容量瓶中，用水定容。该标准系列浓度分别为0.00 g/mL、50 g/mL、100 g/mL、150 g/mL、200 g/mL、250 g/mL。临用前配制。3.13 肝素亲和柱（1mL）：于4冰箱内储存。3.14 0.45 m微孔水相滤膜。4 仪器和设备4.1 高效液相色谱仪：配有二极管阵列检测器（DAD）或紫外检测器。4.2 电子天平：感量为0.01 g和0.01 mg。4.3 冷冻离心机：转速10000 r/min。4.4 pH计：精度为0.01。4.5 涡旋振荡器。5 分析步骤5.1 试样制备5.1.1 液体试样：准确称取5 g(精确至0.01 g)试样（试
5、样中含乳铁蛋白0.1 mg10 mg）于50 mL离心管中，待提取。5.1.2 固体试样：准确称取1 g（精确至0.01 g）试样（试样中含乳铁蛋白0.1 mg10 mg）于50 mL烧杯中，待提取。5.2 提取5.2.1 液体试样：试样中加入5 mL磷酸氢二钠溶液, 涡旋振荡器振荡0.5 min，4下以10000 r/min转速离心10 min，将上清液转移到另一50 mL离心管中。再加入5 mL磷酸氢二钠溶液重复操作一次，合并两次液体作为样品提取液备用。5.2.2 固体试样：试样中加入5 mL温热的磷酸氢二钠溶液（温度不超过50），搅拌使样品完全溶解，将样品全部转入50 mL离心管中。再向
6、原烧杯中加入5 mL磷酸氢二钠溶液，合并两次液体。漩涡振荡器振荡0.5 min，4下以10000 r/min转速离心10 min。将上清液转移到另一50 mL离心管中，再加入5 mL磷酸氢二钠溶液重复操作一次，合并两次液体作为样品提取液备用。5.3净化 肝素亲和柱先加入5 mL磷酸氢二钠溶液平衡，处理完毕后加入样品提取液，待样液完全流出后，再用10 mL磷酸氢二钠溶液(3.7)淋洗，弃去全部流出液。最后用2.5 mL磷酸氢二钠-氯化钠溶液洗脱，收集全部流出液，用磷酸氢二钠-氯化钠溶液(3.7)定容至2.5 mL。将收集溶液过滤膜，供液相色谱检测分析用。5.4 仪器参考条件5.4.1 色谱柱：
7、C4，5 m，300A。（孔径），250 mm4.6 mm（内径）或相当者。5.4.2 检测波长：280 nm。5.4.3 柱温：30。5.4.4 进样体积：50 L。5.4.5 流速：1.0 mL/min。5.4.6流动相：0.1%三氟乙酸溶液和乙腈，梯度洗脱参数见表1。表1 流动相梯度洗脱程序表时间（min）乙腈（%）0.1%三氟乙酸溶液（%）03070555451060401230701630705.5 标准曲线的制作将标准系列工作液分别注入高效液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以标准工作液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。5.6 试样溶液的测定将净化后的试液注入高效液相仪中
8、，得到相对应的峰面积，根据标准曲线得到试液中乳铁蛋白的浓度，平行测定次数不少于2次。6 分析结果的表述试样中乳铁蛋白含量按公式（1）计算： X= .(1) 式中： X试样中乳铁蛋白的含量，单位为毫克每百克（mg/100 g）； C从标准工作曲线中得到的被测组分溶液浓度，单位为微克每毫升（g/mL）； V样品溶液定容体积，单位为毫升（mL）；m试样的质量，单位为克（g）；f稀释倍数。 计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。7 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。8 其他本标准的液态样品检出限为0.6 mg/100g，固态样品检出限为6.0 mg/100g。液态样品定量限为2.0 mg/100g，固态样品定量限为20 mg/100g。附录A乳铁蛋白标准溶液色谱图A.1 0.1 mg/mL乳铁蛋白标准溶液色谱图图A.1 0.1 mg/mL乳铁蛋白标准溶液色谱图
