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1、准备工作:1、进入细胞室前,首先用75%酒精擦试工作台,接着紫外灭菌30-50min,过后,关闭紫外灯,通风10min。2、从冰箱中取出胰酶、PBS缓冲液、培养基开紫外时即将当天实验所用物品拿出,室温放置一段时间注意事项:1、所有实验用的器械,仪器灭菌,消毒,烘干。2、打开溶剂,培养瓶瓶盖时,瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下。3、用完溶剂,培养瓶时,瓶口及瓶盖也要在酒精灯上烤一下。开始工作:1、实验前换衣帽,开风淋,吹风。2、75%乙醇擦手,然后用75%乙醇擦一下台面,点燃酒精灯。3、取待用的细胞,旋紧瓶盖。4、弃去旧的培养液,把培养瓶放回原处。5、取移液管一支,塞棉花端,及管身,均在酒精灯上烤一下
2、,套好吸球。6、用移液管加入适量的PBS缓冲液,缓慢荡洗一下细胞,然后将PBS缓冲液弃掉。整理为word格式7、用移液管(微量枪)吸取适量胰酶约2ml(所用胰酶的量),弃掉枪头。8、将细胞置于5%CO2、37度培养箱中1min-2min,目的:提高酶活性,促进消化。9、取待用细胞,取移液管一支,塞棉花端,及管身,均在酒精灯上烤一下,套好吸球。10、用移液管加入适量的完全培养液冲洗(吹散细胞)细胞,将瓶底粘着的细胞吹散下来,再将细胞悬液移入的离心管中,封口,标签。11、离心5min,1000转/min。以下分别介绍:一 换液1、取待用的细胞,旋紧瓶盖。2、弃去旧的培养液,把培养瓶放回原处。3、取
3、移液管一支,塞棉花端,及管身,均在酒精灯上烤一下,套好吸球。4、用移液管加入适量的PBS缓冲液,缓慢荡洗一下细胞,然后将PBS缓冲液弃掉。整理为word格式5、取移液管一支,塞棉花端,及管身,均在酒精灯上烤一下,套好吸球。6、用移液管加入适量的细胞培养液于培养瓶中。7、将细胞置于5%CO2、37度培养箱培养。二 传代1、细胞离心毕,拆封,瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下,弃去上清液,吸取已配制的培养基适量,加入离心管中,将细胞重悬、吹匀。2、取4-6滴细胞悬液到新的培养瓶中,培养瓶中应先加好适量细胞培养液,吹散细胞,镜下观察,细胞密度适宜则置入5%CO2、37度细胞培养箱中。三 冻存1、细胞离心毕,
4、拆封,瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下,弃去上清液。2、按胎牛血清:DMSO=9:1的比例配制冻存液,装入青霉素瓶中。3、用移液管将冻存液平均加入离心管中,混匀离心管中细胞冻存液。4、用移液管将含细胞的冻存液移入冻存管中,封口,标签。整理为word格式5、冻存,需缓慢冻存,先放置4度冰箱1小时,然后放置-20度冰箱2小时,再置于-80度冰箱过夜,最后置于液氮灌中保存。四 种板1、细胞离心毕,拆封,瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下,弃去上清液。2、取培养瓶及小烧杯各一只,摆放好。3、取移液管一支,塞棉花端,及管身,均在酒精灯上烤一下,套好吸球。4、先移取2ml,5ml,20ml完全培养液,分别加入到离心管,
5、培养瓶,小烧杯中。5、混匀离心管中含完全培养液的细胞,再从离心管中取适量细胞悬液移入培养瓶,吹散细胞。镜下观察,细胞密度适宜则置入5%CO2、37度细胞培养箱中。(细胞传代目的)6、取细胞计数板,盖玻片酒精擦拭,均在酒精灯上烤一下,用微量枪从小烧杯中取出细胞悬液(约10l),弃掉枪头,滴入盖玻片下(不能有气泡,不然会影响细胞计数),镜下观察细胞数(每个象限5个细胞,总和20个细胞,5104个),不断调整小烧杯中细胞悬液的细胞浓度,直至镜下观察细胞数目符合要求。7、取1个96孔板,用酒精棉绕96孔板边缘处擦拭一周,孔板盖在酒精灯上烤一下。整理为word格式8、用微量枪从小烧杯中取出细胞悬液(约1
6、00l),依次滴入96孔板中(枪头至孔下1/3处),同时用移液枪吸取完全培养液(约100l)作为对照或调零,边缘孔用无菌PBS填充。9、滴完后,仍用酒精棉绕96孔板边缘处擦拭一周。10、将96孔板置于5%CO2、37度细胞培养箱中进行培养。五 MTT实验1、接种细胞:用含10胎牛血清的培养液配成单个细胞悬液,以每孔100010000个细胞接种到96孔板,每孔体积100l。2、称取3mg MTT粉末,加6ml完全培养液,配制成浓度5%的MTT溶液,0.22m的微孔滤膜除菌。3、培养细胞:同一般培养条件,培养35天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。4、培养35天后,取出96孔板,用酒精棉绕96
7、孔板边缘处擦拭一周,孔板盖在酒精灯上烤一下。5、用(120l)移液枪小心吸弃孔内培养上清液(包括调零孔内的培养上清液),弃去枪头。再用移液枪按每孔100l加MTT溶液也包括调零孔,但边缘孔除外(枪头在孔上1/3处)。整理为word格式6、呈色:继续孵育4小时,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150l DMSO,置摇床上振荡10分钟,使结晶物充分融解。7、比色:选择490nm波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。六 复苏1、准备工作:开启恒温水浴锅,将温度调节在37,取一离心管,加入
8、5ml细胞培养基。2、取出冻存管,立即放入水浴锅中快速摇晃,让冻存液迅速融化。3、用酒精棉球擦洗冻存管外部以降低污染机会。4、打开冻存管,将冻存液小心转移到预先加入有培养基的离心管中,800rpm离心5分钟。5、小心弃掉上清,加入约5ml培养基重悬细胞。6、将所得细胞悬液转移入培养瓶中,盖上瓶塞,置培养箱培养。整理为word格式换液,传代实验用材:牛奶瓶2个-PBS缓冲液,DMEM培养基血清瓶1个-胰蛋白酶换液:移液管2个传代:培养瓶1个,移液管3个,离心管1个MTT实验用材:试剂:MTT粉,PBS缓冲液,完全培养液,二甲亚砜(DMSO)器材:96孔板,移液管,移液枪,烧杯,青霉素瓶若干,小滤器,微孔滤膜除菌,酶联免疫检测仪。清单:牛奶瓶1个,血清瓶2个,培养瓶3个,移液管5个,离心管2-3个。 友情提示:本资料代表个人观点,如有帮助请下载,谢谢您的浏览! 整理为word格式