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1、实验四 观测鞭毛菌的运动、细菌鞭毛染色3生物基地 01400刘洋-108同组者:吕赞 刘沛余 马华峥一、 实验器材1. 菌种枯草芽孢杆菌（Bcilus subtilis)12d牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物铜绿假单胞菌（Peudmna aeuginos）12d牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物2. 溶液和试剂0.01%美蓝水溶液、硝酸银染液B液3. 仪器和其她用品酒精灯，载玻片,显微镜,双层瓶（内装香柏油和二甲苯）,擦镜纸,接种环，小试管，烧杯,试管架,载玻片夹，滴管，无菌水等二、 实验目的1. 学习并掌握鞭毛染色法并理解鞭毛的形态特性。2. 巩固显微镜操作技术及无菌操作技术。三、 实验原理1.菌种压滴法
2、观测活菌运动鞭毛的功能相称于船的螺浆,在水中可以高速旋转从而推动菌体前行，鞭毛马达还可以转向(从反时针旋转变为顺时针旋转）从而使菌体发生翻滚进而变化细菌的运动方向，事实上细菌在游动时也并不是单纯地始终朝前游,而是随着着不时的随机翻滚转向,但从表观上看仍体现为细菌的前行。细菌未染色时无色透明,在显微镜下重要靠细菌的折光率与周边环境的不同来进行观测。鞭毛的细菌运动活泼，且不同步向一种方向运动，而无鞭毛的细菌则呈不规则布朗运动。这样便可以在光学显微镜下观测到细菌的运动。.鞭毛染色鞭毛是细菌的纤细丝状运动“器官”。鞭毛的有无、数量及着生方式也是细菌分类的重要指标。鞭毛直径一般为1030，只有用电镜才干
3、直接观测到。若要用一般光学显微镜观测,必须使用鞭毛染色法。一方面用媒染剂（如单宁酸或明矾钾)解决,使媒染剂附着在鞭毛上使其加粗,然后用碱性复红（Gry氏染色法)、碱性复品红(Leiso氏染色法)、硝酸银（West氏染色法)或结晶紫(Dife氏染色法）进行染色。四、 实验环节压滴法观测活菌活动1涂片取一块载玻片，在中央滴一滴蒸馏水,用接种环无菌操作从枯草芽孢杆菌（铜绿假单孢菌)斜面上挑数环菌置于载玻片液滴上，小液滴呈混浊状即可。 2. 染色（可省略）取一滴0.0美蓝溶液滴在小液滴上。3. 盖片滴完染色剂后,用镊子夹一干净的盖玻片,先使其一边接触菌液,然后慢慢地放下盖玻片,避免产气愤泡。（盖片要迅
4、速） 4. 镜检盖片完毕后迅速拿到显微镜下观测，将光线合适调暗，先用低倍镜找到观测部位，再用高倍镜观测。要辨别细菌鞭毛运动和布朗运动，后者只是在原处左右摆动,细菌细胞间有明显位移者,才干鉴定为有运动性。（若观测不到,可用油镜)鞭毛染色(硝酸银染色法)1. 载玻片准备将载玻片置于含洗衣粉或洗涤剂的水中煮沸0min，然后用清水充足洗净，再置于95%乙醇中浸泡，使用时取出在火焰上烧去乙醇及也许残留的油迹2. 菌液制备无菌操作用接种环由一般变形菌1418h牛肉膏蛋白胨半固体新鲜培养物平板上挑取数环菌落边沿菌体,悬浮于12L无菌水中制成轻度浑浊的菌悬液，不能剧烈震荡。3. 制片取一滴菌悬液滴到干净载玻片
5、一端，倾斜玻片，使菌悬液缓慢流向另一端,用吸水纸吸去多余菌悬液，自然干燥。4. 染色滴加硝酸银染液A液覆盖菌面35mn后用蒸馏水充足洗去A液。用硝酸银染液B液洗去残留水分后,再滴加B液覆盖菌面数秒至1min，其间可用微火加热,当菌面浮现明显褐色时,立即用蒸馏水冲洗，自然干燥。5. 镜检用油镜镜检检查。五、 注意事项1. 选用活跃生长期菌种进行鞭毛染色，老龄菌鞭毛易脱落。2. 载玻片必须清洁、光滑、无油迹，否则菌液不能散开，导致菌体堆积，鞭毛互相纠缠而难以看清，并且染色后背景脏乱。3. 制片过程中条件要温和，不能剧烈震荡、涂抹菌液，也不能采用加热法进行固定，否则鞭毛易脱落。4. 按规定配制合格的
6、染液。5. 硝酸银染液液染色时间的掌握和Liso氏鞭毛染液最佳染色时间的拟定是本实验能否成功的核心环节。六、 实验成果及分析被杀死的铜绿假单胞菌 运动的枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌观测到周生鞭毛的枯草芽孢杆菌周生鞭毛观测到端生鞭毛的铜绿假单胞菌端生鞭毛七、 成果分析 1.铜绿假单胞菌一开始被杀死的因素也许是染色时间过长。.铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌在压滴法观测中向各个方向运动，可以推断均有鞭毛。3.枯草芽孢杆菌长杆状,菌体长短不一但宽度一致,为周生鞭毛,鞭毛数量多。4.绿假单胞菌两端钝圆短杆状，为端生鞭毛,鞭毛数量少。八、 思考题1. 除鞭毛染色法外，尚有什么措施能观测到鞭毛？可直接在电子显微镜下观测,电子显微镜放大倍数高，可以观测到鞭毛。2. 你对你所做的鞭毛染色成果满意吗?如果不满意，有哪些方面需要改善?如果满意，你的成功经验是什么?不是很满意，冲洗液时有时水流过大使得鞭毛脱落，染色时间控制还不得当。3. 如果你发现鞭毛已与菌体脱离，请解释因素。()也许是菌龄过大，自然脱落；(）操作时玻片受到较强烈的震荡；(3)接种时接种环在玻片上反复涂抹时使之脱落;（4)染色过久使之脱落。
