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1、重组载体质粒扩增的实验步骤：I、感受态细菌的制备（CaCl2化学转化法）准备：LB液体培养基、LB固体平板（含抗生素和未含抗生素）、O.lmol/L氯化钙溶液（预冷）、细菌冻存液（O.lMol/LCaCl2+7%/10%的DMSO或15%的甘油）、高压过的EP管等1、将适合的冻存菌（stbl3）挑取一点（枪头沾取一点）加入盛有1mlLB液体培养基的15ml离心管中；37C,220rpm,摇菌培养1个小时（复苏）。2、取10卩l以下刚复苏的stbl3涂布于非抗性的LB固体培养基上37C过夜培养（纯化）。3、挑取20多个前一天培养的细菌菌落加入3mlLB液体培养基里37C,220rpm,摇菌培养1
2、2个小时（扩增，需使细菌老化，因为下一步摇出的菌才可处于对数生长期）。4、以1：100的比例将3ml培养物转接于300mlLB培养基中，在37C220rpm摇床上剧烈振荡培养约1.5-2小时（使细菌处于对数生长期，易于转化，可每半小时测一下0D600值，使其0.3-0.5）；5、制冰。以下步骤开始注意无菌操作：6将所有培养好的菌液分装移至离心管中，在冰上冷却10分钟；7. 4C下3000g冷冻离心10分钟；8弃去上清，加入30ml预冷0.1Mol/LCaCl2溶液，轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；9.4C下3000g冷冻离心10分钟；10弃去上清，加入5ml预冷0.1Mol
3、/LCaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细菌重新悬浮；11. 4C下3000g冷冻离心10分钟；12. 弃去上清，加6ml0.1Mol/LCaCl2+7%/10%的DMS0或15%的甘油混匀后，分装成100卩l或200ul/EP管（4C预冷），-80C冷冻贮存备用。【练手实验中扩增摇菌时中途摇床关闭了一段时间（具体不详），后续接着摇菌过夜。离心时用的6000rpm，第二次离心时很快溶解，遂进行了第三次离心获取沉淀。配制冻存液忽视了甘油对氯化钙的稀释，用1.8ml50%的甘油加入4.2ml0.1mol/L的氯化钙，即氯化钙的浓度没有达到0.1mol/L。分装时每个EP管含有300ul的感
4、受态细菌。】II、重组载体质粒转化细菌及转化成功细菌（即转化子）的筛选准备：含筛选抗生素的固体培养基、冰、42C水浴锅、37C预热的培养基1、取100卩l感受态细菌在冰上解冻，每管加质粒载体（体积W10ul,DNAW50ng），轻弹以混匀内容物，在冰中放置30min。2、将EP管放到预加温到42C的循环水浴中的浮板上，放置90s2min，不要摇动EP管。3、快速将EP管转移到冰浴上中，使细菌冷却12min4、每离心管加400ulLB培养基，事先用水浴将培养基加温到37C，然后将管转移到37C摇床上，温育45min至1H使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。5、将适当体积（10ul?
5、）已转化的感受态细菌涂布到含相应抗生素抗性（100ug/ml的终浓度）的LB固体培养基上旋转均匀涂布直至有发涩的感觉，即使平板干燥，然后倒置平皿，于37C培养，1216h后可出现菌落（或者将质粒涂布均匀后在37C孵箱里先正放培养30min左右，再倒放培养）。【练手实验中转化VSVG质粒的平板长了2个菌落，而厶8.2质粒的平板貌似没有菌落形成。分析原因排除了平板氨苄青霉素浓度（100ug/ml）太高，可能有两个原因：1、复苏的细菌浓度低，操作时将100卩l感受态细菌加入了800卩l的培养基摇菌，并且只摇菌40min；2、涂板时量太少，只加了20卩l的复苏菌涂布。总的来说可能种在平板上的细菌太少。
6、】III、转化细菌的扩增：准备：LB培养基1、挑取以上培养的转化细菌的单菌落（1至数个）于2.5ml有氨苄抗生素的LB液体培养基里37C220rpm摇菌12H（扩增细菌）2、将上一步摇的2.5ml细菌加入250ml抗性LB液体培养基（氨苄青霉素）里，37C220rpm摇菌24H（扩增质粒）注：扩增的质粒不能立即提取时可将所有菌液转移至离心瓶里6000rpm离心收集细菌沉淀，然后-20C保存。【此次提质粒的细菌连同LB培养基一起冻存了，应把离心弃去培养基后仅冻存沉淀】IV、重组载体质粒提取及纯化（详见试剂盒质粒提取步骤）1用15ml离心管收集1-5ml菌液。12,000rpm离心1min，弃上清
7、。 根据所培养菌体的浓度与质粒的拷贝数，确定收集的菌液量。2加入250ul溶液I/RNaseA混合液，漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮。室温静置1-2min。3加入250ul溶液II，轻柔地反复颠倒混匀5-6次。室温放置1-2min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。不可剧烈混和，否则会使染色体DNA断裂。 此步骤不宜超过5min。4加入350ul溶液III,立即轻柔地反复颠倒混匀5-6次。此时会出现白色絮状沉淀。512,000rpm室温离心10min，收集上清。6将上清置于DNA纯化柱中，静置1-2min。如果收集的上清液过多，超过DNA纯化柱容积（800ul），可将上清分次加入DNA
8、纯化柱中。712,000rpm离心1min，弃滤液。此时质粒DNA被吸附于DNA纯化柱的硅胶膜上。8加入500ul溶液PB，12,000rpm离心1min，弃滤液。 此步骤的作用是将硅胶膜上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱，以获得高质量质粒DNA。9加入500ul溶液W，12,000rpm离心1min，弃滤液。溶液W初次使用前用无水乙醇按1:1.5稀释，即含60%乙醇。10加入500ul溶液W，12,000rpm离心1min，弃滤液。1112,000rpm离心3min，以彻底去除纯化柱中残留的液体。12将DNA纯化柱置于新的离心管中。向纯化柱中央处，悬空滴加50-100ul溶液Eluent，室温放置2
9、min。 12,000rpm离心1min，管底即为高纯度质粒DNA。质粒DNA于-20C保存溶液Eluent可用无菌双蒸水代替，但其pH需为8.0-8.5。溶液Eluent的加入体积视质粒拷贝数多少、依质粒浓度要求而定。V、重组载体质粒的浓度及纯度测定（紫外分光光度法）：测0D260、OD280（先将DNA50倍稀释即2ulDNA加入98ul溶液Eluent中，然后加入比色皿检测）质粒浓度=50XOD260Xn（50为每OD260值代表50ug/ml的双链DNA；OD260为260nm的吸光光度值；n为稀释倍数）质粒纯度=0D260/0D280（比值在1.8-2.0比较纯）【此次提的质粒稀释5
10、0倍后OD260为0.121、0D280为0.123；所以浓度为302.5ng/ul；质粒纯度0D260/0D280为0.983，考虑蛋白参入太多】W、重组载体质粒的鉴定：方法1：双酶切一电泳（插入片段在2Kb以上时）；直接DNA电泳可判断整个重组载体质粒是否正确。方法2：PCR（插入片段在2Kb以下时）一电泳方法3：送公司测序附：LB培养基将下列组分溶解在0.9L水中:10g5g10g蛋白胨酵母提取物氯化钠再补足水至1L。注：琼脂平板需添加琼脂粉12g/L,上层琼脂平板添加琼脂粉7g/L。氨苄青霉素（ampicillin）（100mg/ml）溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10
11、ml,浓度为100mg/m1。分装成小份于-20C贮存。常以25ug/m150ug/m1（还是100ug?）的终浓度添加于生长培养基。重组载体质粒转化细菌方法2：电转化I、电感受态细胞的制备第一天：1. 将适合的冻存菌（DH5a）挑取一点加入盛有lmlLB液体培养基的15ml离心管中；37C,220rpm,摇菌培养1个小时（复苏）。2. 取10卩1以下刚复苏的DH5a涂布于非抗性的LB固体培养基上37C过夜培养。3. 高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）以备第二天摇瓶用4. 准备几瓶灭菌水（总量约1.5升），保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用第二天：5. 挑取单个前一天培养的细菌菌落加入
12、3mlLB液体培养基里37C,220rpm,摇菌培养12个小时。6. 以1：100的比例取1ml菌液加入盛有100mlLB液体培养基的250ml摇瓶中37C,220rpm,振摇2-3小时，定时监控OD.600值（培养1小时后每半小时测定一次）7. 当O.D.600值达到0.3-0.4时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却15min至30min8. 将100ml培养基转移至离心瓶中，4C2500rpm下离心10min，弃上清液。9. 加入几毫升灭菌冰水用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞，然后加水至离心管的2/3体积稀释。10. 4000rpm离心10分钟（还是2500rpm10min?），小心弃去上清液11
13、. 同步骤9用灭菌的冰水重悬浮细胞12. 4000rpm离心10分钟，弃上清液13. 用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞14. 4000rpm离心10分钟，小心弃去上清液（甘油稀释的细菌离心后沉淀更松散，需小心弃液）15. 用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml16. 将细胞按100ul或200ul/管等份装入微量离心管，于-80C保存。【可同时取100卩l感受态细菌加0.01ngpuc18直接电穿孔转化，检测转化效率。次日观察转化子生长情况】II、细胞转化1、事先用无水乙醇清洗浸泡在无水乙醇中的电击杯，于超净台吹干，将载体质粒（名称？）、800ul无抗生素LB和0.1CM的
14、电击杯一起置于冰上预冷。2. 在冰上解冻一管100卩l的电感受态细胞，添加1T0Ul载体质粒（体积？），冰上培育约5分钟。3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器（无泡）中，混匀后转入电击杯中轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部.4. 加载P1000（移液器），准备好800ulLB5. 对电穿孔容器进行脉冲（200欧姆，25uFd,2.5千伏）（检查时间常数，应该在3以上）6按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入800卩l的LB液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。7. 37C220rpm下培养细胞40分钟至1小时以复原8. 5000rpm,5分钟，弃上清剩100ul,涂布到带有抗生素（氨苄青霉素？）的琼脂平板上，放于37C过夜培养，次日查看转化结果.
