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1、学校代码：11059学 号：1302021005下游处理技术XIAYOUC HULIJIS HUZONGSH U论文题目：有机溶剂沉淀法综述学位类别：本科学科专业：生物技术作者姓名：方婷导师姓名：于宙完成时间：2016.5.4有机溶剂沉淀法综述摘要：有机沉淀法是现代沉淀法中比较常用的方法，有机溶剂能降低溶液的电解常数，从而 增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度的降低；有机溶剂能与水作用，破环蛋白 质的水化膜，在一定浓度的有机溶剂中差异中蛋白质分离，常用于蛋白质或酶的提纯。关键词：有机溶剂沉淀；分离；沉淀引言：早期人们认为有机溶剂沉淀法的机理是加入溶剂后，会使水溶液的介电常数降低，而 使蛋
2、白质分子间的静电引力增大，而导致凝集和沉淀。后来又提出一种说法，认为有机溶剂沉淀法的机理是蛋白质纯化，使原来和蛋白质结 合的水被溶剂所取代，从而降低了它们的溶解度。但是这种理论不能说明为什么乙醇比丙 酮的亲水性强，丙酮却比乙醇沉淀蛋白质能力强，也解释不了丙酮、乙醇之类溶剂在所谓 脱去蛋白质水膜的过程中容易造成变性，而盐析脱水时不造成变性。近年来对蛋白质变性的研究有所发展，对有机溶剂沉淀蛋白质的机理有了新的探索认 为有机溶剂可能破坏蛋白质的某种键，使其空间结构发生变化，致使一些在内部疏水基团 暴露于表面，并与有机溶剂的疏水基团结合形成疏水层，从而使蛋白质沉淀。一、有机溶剂沉淀法简介（一）、概念有
3、机溶剂沉淀法是向蛋白质溶液中加入丙酮或乙醇等水溶性有机溶剂，水的活度降低， 水对蛋白表面荷电基团或亲水基团的水化程度降低，溶液介电常数下降，蛋白质分子间静 电引力增加，从而凝聚和沉淀。（二）、选择溶剂选择的原则是：与水可以混溶，不与蛋白反应，沉淀效应良好，无毒。其中主要 效应是水的活度降低。当有机溶剂浓度很大时，水对蛋白质分子表面上核电基因或亲水基 团的水化程度降低，或者说有机溶剂的介电常数降低，因而静电吸力增大，促进了蛋白质 分子的聚集和沉淀。有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一种解释认为与盐析相似，有机溶剂与 蛋白质争夺水化水，致使蛋白质脱除水化膜，而易于聚集形成沉淀。选择的沉淀剂必须是能与水相溶
4、的并且不与酶发生任何作用的有机溶剂，常用的有丙 酮与乙醇。有机溶剂大多数都带有一定的毒性，易使蛋白质构象发生变化而导致变性，所 以在纯化过程中一般采用毒性较小的丙酮以尽量消除这种副作用。（三）、机理向水溶液中加入溶液后降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。主要机理：（1）亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数，使得溶质分子之间的静电 引力增加，聚集形成沉淀。（2）水溶液有机溶剂本身的水合作用降低了自由度的浓度，压缩了亲水溶质分子表 面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。（四）、优缺点有机溶剂沉淀法的优点是溶剂容易蒸发除法，不会残留在成品中，因此适用于制备食品蛋 白质
5、。而且有机溶剂密度低，与沉淀物密度差大，便于离心分离。缺点是，容易使蛋白质变性失活，且有机溶剂易燃、易爆、安全要求高。（五）、影响因素1、温度对有机溶剂沉淀的影响蛋白质在有机溶剂中对温度反应特别敏感，温度稍高即发生变性。因此，加入的有机 溶剂都必须预冷至较低温度，操作要在冰浴中进行，同时加入有机溶剂必须缓慢而又不断 搅拌以免溶剂局部过浓。温度的高低会影响到已沉淀的蛋白质复溶。2、蛋白质浓度对有机溶剂沉淀的影响低浓度样品使用有机溶剂的量大但共沉作用小，利于提高分离的效果；高浓度样品可 以节省有机溶剂，减少变性危险，但共沉作用大，分离效果较差。3、pH值对有机溶剂沉淀的影响在蛋白质结构稳定范围下选
6、择溶解度最低处的pH值，有利于提高沉淀效果。适宜的 pH值可大大提高分离的分辨能力4、金属离子对有机溶剂沉淀的影响一些多价离子如Zn2+和Ca2+在一定的pH值下能与呈阴离子状态的蛋白质形成复合物， 这种复合物在水中或有机溶剂中的溶解度都大大降低，而不影响蛋白质的活性。5、离子强度对有机溶剂沉淀的影响离子强度是影响溶质在有机溶剂及水混合液中溶解度的一个重要因素，盐的浓度大小 或太大都对分离有不利影响，对于蛋白质，在有机溶剂中盐的浓度不超过5%比较合适，使 用的乙醇量也以不超过二倍体积为宜。二、有机溶剂沉淀法实例以乙醇为溶剂，2RNH为沉淀剂，采用有机溶剂沉淀法对湿法磷酸进行净化，在乙醇与 预处
7、理酸体积比为2.0、溶剂沉淀剂用量为3.5%、反应温度40C、反应时间100min条件 下，脱氟率可达到96%以上，磷收率为86%以上。试验结果与讨论：(1) 原料酸预处理实验条件:原料酸500mL，复合脱氟剂用量17.2g，反应温度30C， 搅拌速度300r/min，反应时间2h，静置时间2h，经预处理后的磷酸脱氟率达到65.60%， 磷酸磷收率为92.80%。(2) 单因素实验影响反应的因素主要包括:溶剂沉淀剂种类及用量、溶剂用量、反应温度、 反应时间等，先以单因素实验分别考察各因素对脱氟率的影响以初步确定实验条件范 围。Q.不同溶剂沉淀剂对脱氟效果的影响实验条件:预处理酸与乙醇体积比为1
8、：2，沉淀剂 用量为预处理酸质量的2.5%，搅拌速度300r/min，反应温度25C，反应时间90min，乙 醇均匀缓慢加入。分别以液氨、2RNH和复合沉淀剂(2RNH+液氨)为溶剂沉淀剂。Q.乙醇用量对脱氟效果的影响实验条件：2RNH用量为预处理酸质量的2.5%，搅拌速度 300r/min，反应温度25C，反应时间90min，乙醇均匀缓慢加入。于不同溶剂用量时对 脱氟率进行考察，随乙醇用量的增加，脱氟率逐渐增大，这是因为当乙醇用量增加时，不 溶于乙醇的铵盐及含氟铵盐被析出，脱氟率增加，当乙醇与磷酸体积比为2 : 1时，脱氟 率最高，之后脱氟率随乙醇用量的进一步增加而略有下降，此时磷被同时析出
9、。因此乙 醇用量以乙醇与磷酸体积比2： 1左右为宜5.溶剂沉淀剂RNH2用量对脱氟效果的影响实验条件:预处理酸与乙醇体积比为1 ： 2,搅 拌速度300r/min，反应温度25C，反应时间90min,乙醇均匀缓慢加入，于不同溶剂沉淀 剂用量时进行实验研究。沉淀的条件一经确定，就必须严格控制，才能得到可重复的结果。有机溶剂浓度通常 以有机溶剂和水容积比或用百分浓度表示。有机溶剂沉淀蛋白质分辨力比盐析法好，溶剂 易除去；缺点是易使酶和具有活性的蛋白质变性。故操作时要求条件比盐析严格。对于某 些敏感的酶和蛋白质，使用有机溶剂沉淀尤其要小心。有机溶剂沉淀法的优点是是分辨能 力比盐析法高，溶剂容易除去且
10、可回收，沉淀的蛋白质不需要脱盐处理，缺点是有机溶剂 易使蛋白质或酶变性，常采用降低温度的方法进行有效控制，而且有机溶剂使用量大，溶 剂的使用及回收；储存都比较困难或麻烦。（三）总结有机溶剂沉淀法在沉淀蛋白质时要注意降低温度，能增加收率和减少蛋白质的变性，并且 所选择的溶剂必须能和水互溶，而和蛋白质不起作用。另外，蛋白质的分子量也是影响沉 淀量的，蛋白质的分子量越大，产生沉淀所需加入的有机溶剂量越少。一种蛋白质的溶解 度通常会由于另一蛋白质的存在而降低。沉淀的蛋白质如不能再溶解，就可能已经变性。 对很多酶，丙酮加量在20%50%之间，就能产生沉淀。接近等电点时，以引起沉淀所需加 入有机溶剂的量较
11、少，当溶剂量达到50%时，则通常只有分子量小于15000的蛋白质仍留 在溶液中，少量中性盐的存在能产生盐溶作用，增加蛋白质在有机溶剂水溶液的溶解度。有机溶剂沉淀法得到的某些蛋白质沉淀浓度范围宽，所得产品纯度也较高，从沉淀的蛋白质中除去有机 溶剂很方便，而且有机溶剂本身可以作为蛋白质的杀菌剂。在未来有机溶剂沉淀法将成为沉淀蛋白质的 重要方法之一。参考文献1严希康，生物物质分离工程M，2版。北京：化学工业出版社，2010.2, 218-219.2孙彦，生物分离工程M，2版，北京：化学工业出版社，2005.3 邓旭，李清彪，孙道等.从大蒜细胞中分离纯化出超氧化物歧化酶】J,食品科 学 2001,22(9):48.4 俞俊棠，唐孝宣，鄙行彦，李友荣，金青萍.新编生物工艺学下册M, 1版北京： 化学工业出版社，2003，42-43.5 杨博,王永华食品与发酵工业2000，27 (2)： 7679.
