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1、EGFP在肿瘤细胞中的表达分析黄娟西南大学生命科学学院，重庆400715目录摘要错误！未定义书签。Abstract 错误！未定义书签。第一章文献综述错误！未定义书签。1.1 HTERT基因在肿瘤治疗中的研究进展 错误！未定义书签。1.1.1 HTERT基因的发现错误！未定义书签。1.1.2 HTERT基因的结构和特征错误！未定义书签。1.2 HTERT基因在肿瘤治疗中的生物学意义 错误！未定义书签。1.2.1端粒与端粒酶错误！未定义书签。1.2.2端粒酶与肿瘤的关系错误！未定义书签。1.2.3针对端粒酶的抗肿瘤治疗错误！未定义书签。1.3 HTERT基因肿瘤在治疗中的研究进展 错误！未定义书签
2、。1.3.1 HTERT 基因肿瘤治疗中的发展前景错误！未定义书签。1.3.2 HTERT 基因在肿瘤在治疗中的存在的问题.错误！未定义书签。1.3.3 HTERT 基因在肿瘤治疗中的展望错误！未定义书签。第二章引言错误！未定义书签。第三章材料与方法错误！未定义书签。3.1实验材料错误！未定义书签。3.1.1实验动物 错误！未定义书签。3.1.2主要仪器与设备错误！未定义书签。3.1.3主要试剂、培养基和试剂盒错误！未定义书签。3.1.4常用试剂及其配制 错误！未定义书签。3.1.5常用生物信息学网站和分析软件错误！未定义书签。3.2实验方法错误！未定义书签。3.2.1猪基因组DNA的提取 错
3、误！未定义书签。3.2.2总RNA的提取及cDNA的制备错误！未定义书签。3.2.3 EST拼接和引物设计错误！未定义书签。3.2.4 PCR及PCR-RFLP分析错误！未定义书签。3.2.5 PCR产物的纯化、克隆和测序错误！未定义书签。3.2.6印记分析错误！未定义书签。3.2.7基因组织表达半定量分析错误！未定义书签。3.2.8基因定位分析错误！未定义书签。第四章结果与分析错误！未定义书签。4.1基因组DNA的提取错误！未定义书签。4.2总RNA的提取与cDNA的制备错误！未定义书签。4.2. 1总RNA的提取 错误！未定义书签。4.2.2 cDNA的制备与检测错误！未定义书签。4.3四
4、个候选基因的克隆、印记鉴定与基因定位错误！未定义书签。4错误！未定义书签。4.3.2猪GTL2基因 错误！未定义书签。4.3.3猪RTL1基因错误！未定义书签。4.3.4猪DIO3基因错误！未定义书签。第五章讨论错误！未定义书签。5.1印记基因的分离错误！未定义书签。5.2印记基因表达的研究方法错误！未定义书签。5.2.1基于“表达的SNP”的分析方法错误！未定义书签。5.2.2应用品种间正反交模型分析印记基因的可行性错误！未定义书签。5.3四个候选印记基因的表达状况错误！未定义书签。5.3.1 DLK1基因错误！未定义书签。5.3.2 GTL2基因 错误！未定义书签。5.3.3 RTL1基因
5、 错误！未定义书签。5.3.4 DIO3基因错误！未定义书签。5.4 RTL1和DIO3基因的遗传定位错误！未定义书签。5.5印记基因与动物遗传育种错误！未定义书签。参考文献错误！未定义书签。致谢错误！未定义书签。发表论文及参加课题一览表错误！未定义书签。摘要：【目的】构建携带有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）质粒载体，通过将启动子置换成端 粒酶（HTERT ）启动子，使其能在肿瘤细胞中特异性的表达，观察EGFP的表达情况以及对靶 细胞生物活性的特异性的影响。【方法】以质粒pEGFP-N3为模板进行PCR反应获得完整保留 PEGFP-N3的多克隆酶切位点的EGFP基因片段，定向插入更换启动子的p
6、Lenti6V5DTop质粒 中，其启动子由原来的PCMV置换为HTERT启动子，筛选出正确的重组绿色荧光蛋白基因的 重组载体pLenti6V5DTop-EGFP，在阳离子脂质体的作用下导入肿瘤细胞后，获得具 有绿色荧光蛋白颗粒的表达产物，通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白作为目的基 因在体外的表达情况，以及对肿瘤细胞生物活性的影响。【结果】成功克隆携带 有EGFP基因的载体，该载体经导入人的肿瘤细胞后产生稳定的表达产物。人体肿瘤细胞EGFP genes expression and analysis in cancer cell of humanjuan huangSchool of Life
7、Science, Southwest China University, Chongqing 400715, Chinafluorescent proteinAbstract：【objective】 to construct the plasmid carrying enhanced green(EGFP)gene and to observe the expression of green fluorescent proteinin in human cancer cells. 【methods】【results 1【conclusionKey words： green fluorescen
8、t protein (EGFP)gene ;pLenti6V5DTop plasmid ;HTERT promoter;translate;human cancer cells;第一部分文献综述1.1 HTERT基因在肿瘤治疗中的研究进展1.1.1、HTERT基因的发现1985年Blackburn研究小组首先在四膜虫中发现了催化合成端粒重复序列的 端粒酶(Telomerase)衍。之后耶鲁大学Morin(1989)在人宫颈癌细胞中也发现了人 端粒酶。端粒酶是一种核糖核蛋白，它由蛋白质和与端粒DNA互补的RNA 所组成，它能以自身的RNA为模板合成端粒DNA，本质上属逆转录酶。目前， 包括人的多
9、种生物的端粒酶RNA组份及其基因已被克隆口9, 21，而四膜虫、线 虫、酵母、小鼠及人端粒酶的蛋白组份及其基因也已纯化和克隆成功10A。1.1.2、HTERT的结构和特征在脊椎动物端粒的DNA结构为5(TTAGGG)n-3重复序列，调节蛋白 (Telomerase Regulatory Factors,TRF1、TRF2)，二者 C-末端都有特异性的 Myb 重复序列同源保守域(telobox)，可特异性识别并结合端粒的双链DNA及3端富 G的单链尾。中间部分都有长约200核苷酸的同源二聚体化域。所不同的是TRF1 的N-末端是酸性基因，而TRF2的N-G末端是碱性基因。野生型TRF1过表达可
10、 导致端粒进行性缩短，而突变型(缺失DNA-结合域)TRF1可延长端粒，表明它 调节端粒酶依赖的端粒长度。TRF1蛋白结合于端粒重复序列上数量可作为负性的长度依赖性的调节因子。突变（显性失活）TRF2过表达的细胞表现为端粒缩 短，结合于双链DNA的TRF2减少，未端单链G尾丢失，引发由P53介导的损 伤途径，染色体出现端端融合、有丝分裂的发生率异常升高甚至直接导致细胞凋 亡。提示TRF2的作用在于调节端粒的功能。它通过维持端粒功能性单链3-G尾 的稳定而直到防止其端端融合而保护染色体及细胞的完整性。然而该模式无法解 释为何结合双链DNA上的TRF2蛋白影响到单链G尾的稳定性及何染色体末端 单链
11、G尾不被当作DNA损伤问题。Griffith等结合电镜观察提出端粒结构假说 D-loop-T-loop。由于TRF2的存在，DNA双链形成“环状（T-loop） ”，而单 链G尾的TTAAGGG在环的端口内侧与CCCTAA碱基互补形成100-200碱基对 D-loop，由此保护了 DNA末端不受损坏，而TRF2蛋白很可能结合于D-loop接 口处参与了 T-loop-D-loop的形成与稳定。T不结构模式亦直接或间接地参与染 色体末端结构稳定性的维持。TRF2对端粒结构的稳定可能提示了端粒酶的其他 作用；随着DNA复制，端粒逐渐缩短，TRF2结合位点逐渐减少至消失，端粒失 去了 TRF2的保护
12、作用。端粒酶通过在端粒末端合成TTAGGG重复片段而提供 TRF2结合位点，使TRF2蛋白结合于其上行使防止染色体融合的功能。近年来肿瘤的端粒-端粒酶假说已被越来越多的实验所证实。85%以上的恶 性肿瘤有端粒酶表达，而正常组织（生殖细胞、造血细胞等胚胎性干细胞除外）则 呈阴性。端粒酶是迄今发现的一个最为广泛的肿瘤标志，在细胞永生化和肿瘤发 生发展过程中起重要作用。自从1995年Feng等研究发现反义人端粒酶基因能抑 制HeLa细胞端粒酶活性并导致其死亡以来，针对端粒酶开发新的抗肿瘤药物已 成为近年来的新热点。12、HTERT在肿瘤治疗中的生物学意义1.2.1、端粒和端粒酶早在本世纪三四十年代M
13、%26uuml;ller和McClintock就认识到染色体末端 存在一种维持染色体稳定和完整的特殊结构 端粒（telomere），它能防止染色 体DNA降解、末端融合、缺失和非正常重组1，2。但直到20年前，人们才相继 辨明了多种物种的端粒结构由58 bp且富含G碱基核苷酸串联重复序列和 端粒结构蛋白构成，人和其它脊椎动物的端粒DNA均为（TTAGGG）n3。端粒结 构的阐明圆满解决了令人困惑的染色体末端复制难题S。DNA复制时DNA多 聚酶必须以RNA为引物，从5端向3端方向复制，复制完成后RNA引物被降解, 所留5端空隙由端粒DNA来填补，防止染色体末端DNA在复制过程中的不断 丢失，从
14、而维持了染色体结构的完整性。肿瘤的“端粒-端粒酶”假说：在对端粒和端粒酶深入研究的基础上， Harley(1991)提出了“端粒-端粒酶假说”。他认为，端粒可能是细胞有丝分裂的 计时钟(mitotic clock)。在细胞有丝分裂过程中，端粒DNA不断丢失而使端粒缩 短，当端粒缩短到一定长度时，可能会触发某种信号，使细胞进入前临转点M1 期，此时细胞不再分裂，而是退出细胞周期而老化。如果此时细胞被病毒转化、 癌基因激活或抑癌基因失活，细胞便可越过M1期继续分裂，端粒继续缩短，最 终进入后临转点M2期。多数细胞由于端粒太短而失去功能并死亡，但极少数细 胞的端粒酶在此阶段被激活，从而恢复端粒的功能
15、，使细胞逃避死亡而获得永生 化。122、端粒酶与肿瘤的关系“端粒-端粒酶”假说认为端粒酶的再激活与细胞永生化和恶性肿瘤的发生发 展有密切关系，大量研究已证实了此推断。Kim等14检测了 100株人肿瘤细胞 系的端粒酶活性，98%呈阳性，而22个正常细胞株端粒酶均为阴性。张桥等 总结了近年来人类肿瘤组织端粒酶活性的测定结果，表明人肿瘤端粒酶活性的阳 性率高达84.3%(766/909)，而相应的正常、瘤旁组织及良性肿瘤端粒酶阳性率仅 为3.4%(12/352)。Counter等16, 17检测了 SV40、HPV或AD5转化前后的人胚肾 细胞和人上皮端粒长度和端粒酶活性，结果发现转化后的永生化细胞端粒长度 趋于稳定并伴有端粒酶的激活。Bednarek等血进一步研究了化学诱导的鼠皮肤 乳头状瘤发生发展过程中端粒酶活性变化，结果发现在10周内11例中只有1例显 示高水平的端粒酶活性，而到30周时所有的标本均显示出了高水平的端粒酶活 性，表明肿瘤的发生发展与端粒酶活化有密切关系。Hiyama等：19, 20对乳腺癌 胃癌病人的研究发现，端粒酶阳性者肿瘤体积较大、淋巴结转移率高、预后差。123、针对端粒酶的抗肿瘤治疗由于端粒酶特异性地表达于绝大多
