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1、液相色谱仪、气相色谱仪、原子吸收分光光度计、红外光谱仪、核磁共振、原子发射光谱等分析仪器气相色谱仪使用方法及实验操作步骤：A、打开氮气、氢气、空气发生器的电源开关（或氮气钢瓶总阀），调整输出压力稳定在0.4Mpa左右（气体发生器一般在出厂时已调整好，不用再调整）。B、打开色谱仪气体净化器的氮气开关转到“开”的位置。注意观察色谱仪载气B的柱前压上升并稳定大约5分钟后，打开色谱仪的电源开关。C、设置各工作部温度。TVOC分析的条件设置：（a）柱箱：柱箱初始温度50C、初始时间lOmin、 升温速率5C/min、终止温度250C、终止时间lOmin; （b）进样器和检测器：都是250C。脂肪酸分析时
2、的 色谱条件：（a）柱箱：柱箱初始温度140C、初始时间5min、升温速率4C/min、终止温度240C、终止时 间15min; （b）进样器温度是260C，检测器温度是280C。D、点火：待检测器（按“显示、换档、检测器”可查看检测器温度）温度升到150C以上后， 打开净化器上的氢气、空气开关阀到“开”的位置。观察色谱仪上的氢气和空气压力表分别稳定在O.lMpa 和0.15Mpa左右。按住点火开关（每次点火时间不能超过68秒钟）点火。同时用明亮的金属片靠近检测 器出口，当火点着时在金属片上会看到有明显的水汽。如果在68秒时间氢气没有被点燃，要松开点火开 关，再重新点火。在点火操作的过程中，如
3、果发现检测器出口白色的聚四氟帽中有水凝结，可旋下检测器 收集极帽，把水清理掉。在色谱工作站上判断氢火焰是否点燃的方法：观察基线在氢火焰点着后的电压值 应高于点火之前。E、打开电脑及工作站（通道一分析脂肪酸，通道二分析碘），打开一个方法文件：脂肪酸分析 方法或碘分析方法。显示屏左下方应有蓝字显示当前的电压值和时间。接着可以转动色谱仪放大器面板上 点火按钮上边的“粗调”旋钮，检查信号是否为通路（转动“粗调”旋钮时，基线应随着变化）。待基线稳 定后进样品并同时点击“启动”按钮或按一下色谱仪旁边的快捷按钮，进行色谱数据分析。分析结束时， 点击“停止”按钮，数据即自动保存。F、关机程序：首先关闭氢气和空
4、气气源，使氢火焰检测器灭火。在氢火焰熄灭后再将柱箱的初 始温度、检测器温度及进样器温度设置为室温（20-30C），待温度降至设置温度后，关闭色谱仪电源。最 后再关闭氮气。高效液相色谱我国药典收载高效液相色谱法项目和数量比较表：方法项目1985年版HPLC 法鉴别检查含量测定7数量1990年版1995年版2000年版934150124016060117387鉴于HPLC应用在药品分析中越来越多，因此每一个药品分析人员应该掌握并应用HPLC。三、色谱法分类 3四、色谱分离原理 4II. 基本概念和理论5一、基本概念和术语 5二、塔板理论 8三、速率理论（又称随机模型理论）9III. HPLC 系统
5、 11一、输液泵 11二、进样器 13三、色谱柱 14四、检测器 16五、数据处理和计算机控制系统 19六、恒温装置 20IV. 固定相和流动相20一、基质（担体） 20二、化学键合固定相 22三、流动相 231. 流动相的性质要求 232. 流动相的选择 243. 流动相的 pH 值 244. 流动相的脱气 245. 流动相的滤过 256. 流动相的贮存 257. 卤代有机溶剂应特别注意的问题268. HPLC 用水 26VHPLC 应用 26一、样品测定 26二、方法研究 27附件：高效液相色谱法（HPLC）复核细则27一、对起草单位的要求： 27二、对复核单位的要求： 28二、HPLC的
6、特点和优点HPLC 有以下特点：高压压力可达150300 Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。高速流速为 0.110.0 ml/min。高效可达 5000 塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达 100 种。高灵敏度一一紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。HPLC 与经典液相色谱相比有以下优点：速度快一一通常分析一个样品在1530 min，有些样品甚至在5 min即可完成。分辨率高可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。灵敏度高紫外检测器可达O.OIng，荧光和电化学检测器可达O.lpg。柱子可反复使用用一根色谱柱可分离不同的化合物。样品量少，容易回收样品经过色谱
7、柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。三、色谱法分类按两相的物理状态可分为：气相色谱法（GC）和液相色谱法（LC）。气相色谱法适用于分离挥发性化合物。GC根据固定相不同又可分为气固色谱法（GSC）和气液色谱法（GLC）,其中以GLC应用最广。液相色谱法适 用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。LC同样可分为液固色谱法（LSC）和液液色谱法（LLC）。 此外还有超临界流体色谱法（SFC）,它以超临界流体（界于气体和液体之间的一种物相）为流动相（常用 co2），因其扩散系数大，能很快达到平衡，故分析时间短，特别适用于手性化合物的拆分。按原理分为吸附色谱法（AC）、分配色谱法（DC）、离子
8、交换色谱法（IEC）、排阻色谱法（EC，又称分子筛、 凝胶过滤（GFC）、凝胶渗透色谱法（GPC）和亲和色谱法。（此外还有电泳。）按操作形式可分为纸色谱法（PC）、薄层色谱法（TLC）、柱色谱法。四、色谱分离原理高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换 色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。1液固色谱法 使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不 同而分离。分离过程是一个吸附一解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度510ym。适用 于分离分子量2001000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物
9、易产生拖尾。常用于分离同分 异构体。2液液色谱法 使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离 原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表面流失；温 度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收 集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。现在多采用的是化学键合固定相， 如 C18 、 C8 、氨基柱、氰基柱和苯基柱。液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法（NPC）
10、和反相色谱法（RPC）。正相色谱法 采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶 剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。 常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。反相色谱法一般用非极性固定相（如c18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、 丙酮、四氢咲喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在 现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用围逐渐扩大，现已应
11、用于某些无机样品或易解离样品的分 析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH 值通常为 2.57.5（28），太高的 pH 值会使硅胶溶解，太低的 pH 值会使键合的烷基脱落。有报告新商品 柱可在 pH 1.510 围操作。正相色谱法与反相色谱法比较表正相色谱法反相色谱法固定相极性高中中低流动相极性低中中高组分洗脱次序极性小先洗出极性大先洗出从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）。3离子交换色谱法 固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未 端芳环上接上羧基、磺酸
12、基(称阳离子交换树脂)或季氨基(阴离子交换树脂)。被分离组分在色谱柱上 分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离 子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上 的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流动相的pH值和离子强度影响。pH值可改变化合物的解离程度， 进而影响其与固定相的作用。流动相的盐浓度大，则离子强度高，不利于样品的解离，导致样品较快流出离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。4离子对色谱法 又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。它
13、是根据被测组分离子与离子对试剂离 子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善。主要用于分析离 子强度大的酸碱物质。分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。另外高氯酸、三氟乙 酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。离子对色谱法常用ODS柱(即C18，流动相为甲醇-水或乙腈-水，水中加入310 mmol/L的离子对试 剂，在一定的 pH 值围进行分离。被测组分保时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其 pH 值、离子强度 有关。5排阻色谱法 固定相是有一定孔径的多孔性填料，流
14、动相是可以溶解样品的溶剂。小分子量的化合 物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。它利用分子筛对分 子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋 白质、核酸等。II.基本概念和理论一、基本概念和术语1 .色谱图和峰参数A色谱图(chromatogram)样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。A基线(base line)经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。 一般应平行于时间轴。A噪音(noise)基线信号的波动。通常因电源
15、接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含 有气泡或色谱柱被污染所致。A漂移(drift)基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不 稳定所引起，柱的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。A色谱峰(peak) 组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正 常色谱峰近似于对称形正态分布曲线(高斯Gauss曲线)。不对称色谱峰有两种：前延峰(leading peak) 和拖尾峰(tailing peak)。前者少见。A拖尾因子(tailing factor, T)T=，用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子(symmetryfactor)或不对称因子(asymmetry factor)。中国药典规定T应为0.95T.05。TV0.95为前延峰，T 1.05为拖尾峰。A峰底基线上峰的起点至终点的距离。A峰高(peak height, h)峰的最高点至峰底的距离。A峰宽(pea
