小分子连接4

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1、二、交联方法的选择及偶合物的设计如上所述，蛋白质交联方法的类型繁多，虽然能够满足各方面的需要，但也增加了使用者选择的困难。 评价某一交联方法时，应该考虑以下有关因素：交联反应的效果，如交联产物组成的均一性;交联反应 的产率;交联过程对生物活性的影响；交联操作的简便性；交联产物纯化的难易；交联反应结果的 可重复性；偶合物的使用目的。理想的交联方法应该保证结合物得率较高，结合物的组成均一，结合比 合适，最大限度地保持生物活性，操作方便，纯化容易；在同样条件下，重复性好。然而，目前还没有一种交联方法能够同时满足上述要求。由此，必须根据结合物的使用目的，权衡不 同方法的优缺点来选择合适的交联方法；最好

2、同时使用几种交联方法进行比较，择其优者而用之。在人工抗原的制备中，主要要求制备的人工抗原保持半抗原的结构特异性；所用交联方法不要明显改 变半抗原结构，要保留抗原决定簇。必要时可在半抗原与载体之间引入一定碳链长度的桥结构，暴露抗原 决定簇，以利于产生针对半抗原的抗体。影响人工抗原的免疫效果的另一重要因素是每分子载体上结合的药物分子数。一般认为药物结合量越 大越好，但最佳结合比也取决于半抗原的本质及载体的性质。由于抗体的特异性主要针对半抗原分子中远 离偶联键的结构，因此，在设计人工抗原结合物时，应选择远离半抗原特征结构的基团进行交联。例如， 与抗睾酮17牛血清白蛋白相比，抗睾酮3牛血清白蛋白能够更

3、好地识别类似结构的甾体化合 物。通过桥结构将载体蛋白连接于抗原分子中非生物特异性的位置如雌激素的 C6 位，黄体酮的 C6 或 C11 位，制备的人工抗原结合物具有更好的特异性。由这些结合物产生的抗体能够识别半抗原的所有 结构特征。相应地，抗半抗原的抗体对结合部位或邻近结合部位的结构变化是不敏感的，如 3-羧甲基吗啡蛋白 结合物诱生的抗体不能区分吗啡和可待因11。还原青蒿素蛋白结合物所诱生的抗体可以用于测定青蒿 素、蒿甲醚及青蒿酯12。而通过不同方法制备的安定 的两种蛋白偶合物所产生的抗体，都能特异性地识别安定。这些性质给人工抗原的制备带来极为有利的条 件，人们可以适当改变半抗原结合部位的结构

4、或引入交联活性基团，使制备人工抗原的方法更加多样化。BSA- BSA对于酶标抗体的制备，最重要的是同时保持酶和抗体的生物学活性，制备化学组份均一的结合物。异 型双功能交联试剂的应用，基本实现了交联反应的控制进行，减少或避免了自身聚合和交叉聚合，保证了 交联产物的有效性。对于载体药物，首先要求其能够在体内定量或定位地释放出具有生物活性的游离药物。为此，连接药 物与载体的偶合键必须能够在一定条件下以一定速度解离，而且解离速度能够通过pH的改变或体内不同 组织小环境的差异（如酶的种类或活性）得到调控，以达到定向给药的目的；在制备载体药物结合物时，对药R-*COCH*CHfCOOH物分子的结构不宜作永

5、久性的改变，以免引起生物活性的改变；其次还要求每一载体能结合足够量的药物 分子，以保证给药的效率。在抗体导向药物的设计和制备中应该考虑以下几点：细胞毒分子一抗体偶合物在到达作用部位以前 保持稳定，在血浆中不被降解；结合物的特异性能够反映载体的特异性，即具有原载体的专一性识别和 结合作用；结合物到达作用部位以后，能以某种方式进入细胞，发挥药理作用，即结合物本身具有细胞 毒活性或结合物进入细胞后能够释放活性形式的药物。因此，对细胞毒分子中药物活性所必需的部位不宜作不可逆化学修饰，而且偶联键要远离活性部位， 以避免立体位阻对生物活性的影响。如甲氨蝶吟分子中的蝶吟部分对二氢叶酸还原酶有高度的亲和性，是

6、 抗代谢活性的必需结构，对其进行任何改变，均可导致药物活性的丧失；但是，远离蝶吟的谷氨酸残基， 对酶抑制活性影响不大，可以用作交联基团。又如将细胞毒分子连接于抗体分子中远离抗原结合位点的 Fc 区，可以最大限度地保持抗体活性13。利用血浆与溶酶体pH的差别，设计pH敏感的偶联键，制备药物载体偶合物，可以实现药物的控制 释放14,15。如柔红霉素通过顺一乌头酸与蛋白形成的结合物，在生理pH时稳定；而进入细胞后，可以 在溶酶体的酸性条件（pH45）下解离，释放柔红霉素原型药物分子，发挥细胞毒作用14。不论使用哪种蛋白载体，其所能提供的交联基团是相似的。因此，交联方法的选择以及交联物的设计 主要取决

7、于半抗原或药物分子上的功能团结构，下面就根据这些功能团的分类，分别讨论不同交联方法的 应用。（一）羧基药物或其衍生物分子上的羧基可以通过碳二亚胺法、混合酸酐法等与蛋上的氨基形成酰胺键，其中碳 二亚胺法在这类化合物的偶联反应中的应用最为广泛。血管紧张素和缓激肽、促胃液素、吗啡、前列腺素、 托普霉素、一BE阿糖咲喃胞嘧啶、强的松一21琥珀酸半酯等均可在水溶性碳二亚胺BDC的作用下， 与蛋白或多聚氨基酸等载体结合，制备人工抗原。许多含羧基的抗肿瘤药物如甲氨蝶呤2、苯丁酸氮芥、 柔红霉素的二元酸单酯衍生物、丝裂霉素C戊二酸单酯16、新制癌菌素17和磷酸酯酶C等均可 在EDC作用下与抗体偶联，制备抗体导

8、向偶合物。同时含有氨基和羧基的小分子，可以先将氨基保护后，再用羧基与载体交联，以避免自身缩合，交联 反应完成后再脱保护，游离氨基。不溶于水的药物可先以二甲基甲酰胺溶解，然后再加于蛋白水溶液中， 进行交联反应。为了减少蛋白分子间的自身聚合，可以先将药物分子上的羧基转化为N羟基琥珀酰亚胺的活泼酯， 然后再与抗体交联。例如，将丝裂霉素C戊二酸单酯转化为活泼酯后，再与抗体交联，可以提高蛋白回 收率和产品的均一性，更好地保持抗体活性18。类似地，可以制备D，L10, 11环氧麝子油酸及蜕皮 激素的入工抗原结合物。混合酸酐法也能用于形成酰胺键。通过混合酸酐法与蛋白载体交联的半抗原有考的松21琥珀酸半 酯、

9、尿核苷一5磷酸、睾酮一17琥珀酸半酯、30琥珀酰毛地黄毒貳配基、胆酸、甲状腺素及利 血平等。药物及半抗原的羧酸酯、活泼酯或酸酐衍生物可以与肼反应，转化为相对稳定的酰肼物。后者在水性 介质中，很容易和蛋白分子上的醛基或酮基（由高碘酸钠氧化 IgG 分子上的糖残基产生）反应，形成腙结构 的结合物。此外，药物分子中的羧基还可以转变为酰基叠氮衍生物，然后再与蛋白分子上的氨基反应，形成以酰 胺键连接的结合物，酰基叠氮衍生物可以由酰肼与冷的亚硝酸反应制备，也可以通过酰氯与叠氮钠反应产 生。通过这种方法与蛋白交联的有阿斯匹林、去乙、酰长春花碱、甲状腺素等。（二）氨基含氨基的半抗原及药物可以分为两类，即芳香胺

10、类和脂肪胺类。这两类胺的交联方法有所不同，下面 分别讨论。许多芳香胺类的化合物可以在低温条件下与亚硝酸反应形成重氮盐，然后与载体蛋白分子上的酪氨酸 或组氨酸残基反应，形成以偶氮键交联的结合物。芳香环上含硝基的化合物如氯霉素，可将硝基还原为氨 基后，再制备重氮盐，与蛋白载体结合。但是，重氮盐交联法存在难以克服的副反应，可导致蛋白大量沉 淀；而且，与重氮盐反应的酪氨酸和组氨酸残基多存在于IgG分子中抗原结合区及其附近，因此交联反应 易导致抗体活性的损失。所以这一方法一船不用于抗体导向药物的制备中。脂肪胺类化合物可以在水溶性碳二亚胺作用下，与载体蛋白上的羧基结合。用此方法连接的半抗原 有缓激肽、血管

11、紧张素、托普霉素、庆大霉素、阿霉素、5-羟色胺及精脒等到。脂肪胺还可以与一硝基苯 甲酰氯反应，形成对-硝基苯甲酰衍生物，再将硝基还原为氨基后，通过重氮化与载体蛋白结合，以此法交 障的半抗原有烟草花叶病病毒蛋白及血管紧张素等。通过双功能交联剂苯甲基二异氰酸酯将胺类化合物与 蛋白上的氨基连接，可以制备缓激肽的人工抗原结合物。药物分子上的胺基还可以通过戊二醛试剂与蛋白 分子上的氨基结合，由此可以制备促肾上腺皮质激素、高血糖素及支甲肾上腺素等到的人工抗原结合物和 阿霉素-抗菌素体导向偶合物44。以上交联方法均是利用职权同型双功能交联剂连接两分子上氨基。在交联过程中，不可避免地会形成 部分相同分子间的聚

12、合产物。为了达到控制交联的目的，可以利用多元酸酐法，于含氨基的半抗原分子上 引入游离羧基,然后再以活泼酯法或碳二亚胺法与蛋白交联。如先将柔红霉素与琥珀酸酐或顺乌头酸酐反 应，再利用引进的羧基与抗体上的氨基反应，形成抗体导向偶合物8。也可以通过与SPDP反应，于半抗 原分子上引入巯基，利用巯基反应与抗体交联。（三）羟基含有羟基的半抗原分子包括醇类、酚类、糖类及核苷酸类。在这类化合物的交联中，通常先要制备其 衍生物，以引进能够与蛋白反应的功能团。例如，甾体化合物可以通过与琥珀酸酐反应，形成琥珀酸单酯 衍生物，然后按羧基交联方法与蛋白偶联。按照类似方法可以制备环腺苷酸、雌酮、Bdl美沙醇、3羟 基氯

13、硝安定、蜕皮甾酮、心得安、A9四氢大麻酚及1BD阿糖咲喃胞苷的蛋白结合物。也可以将醇 羟基与光气反应，制备高度反应活性的氯甲酸酯，然后在碳酸氢盐存在下与蛋白分子上的氨基交联。三氯三嗪或羧甲基取代的二氯三嗪试剂可以连接药物分子上的羟基与蛋白分子上的氨基，交联分两步 进行，羟基化合物先与三嗪试剂反应，形成醚衍生物；剩余的取代氯反应活性较差，不能再羟基取代，但 可与亲核性较强的蛋白氨基反应，由此形成通过三嗪核偶联的结合物。双功能交联剂卤代硝基苯也可以用 于连接药物分子上的羟基和蛋白分子上的氨基。酚类化合物可以通过与重氮化的-氨基苯甲酸反应，引入羧基，然后利用羧基反应与蛋白交联。这一类 型的反应被成功

14、地用于制备17，B雌二醇及（）7-四氢大麻酚的人工抗原结合物。具有邻二醇结构的核苷或核苷酸类化合物，可用高碘酸盐氧化出醛基，后者可以与，蛋白分子上的氨 基反应形成 Schiff 氏碱，以硼氢化钠还原后即可得到稳定的以碳氮单应过程中，毋需分离中向产物，本 法成功地用于制备地高辛及G-毒毛旋花子貳的蛋白结合物。改进法被用于制备碱敏感性的核苷及核苷酸结 合物。用高碘酸盐氧化法制备的抗体导向偶合物有柔红霉素右旋糖苷抗体结合物及柔红霉素抗体 偶合物。后者是通过氧化右旋糖苷上的邻二醇为醛基，利用醛基分别连接药物和抗体分子上的氨基制备而 成。但本法也可以产生副产物，而且硼氢化还原可能破坏药物结构，影响药物活

15、性19.用高碘酸钠氧化抗 体 IgG 分子 Fc 端的糖基，利用生成的醛基与氨基化合物交联。这样，将细胞毒组份区域选择性地连接于 远离抗原结合位点的 Fc 端，可以更好地保持抗体活性。（四）羰基醛基化合物如吡哆醛及毗哆醛磷酸酯可以通过与蛋白分子上的氨基形成Schiff氏碱，实现与蛋白的交 联。醛或酮均可以通过与O羧甲基一羟胺反应，转化为0羧甲基一肟衍生物,引入一个羧基，通过形成 酰胺键与蛋白交联。以这种方法交联的半抗原分子有睾酮、孕酮、雌酮及18乙基炔诺酮。醛固酮及考的 松等与对肼基苯甲酸反应，再利用引入的羧基与牛血清白蛋白交联。在羰基的。位引入一个卤素原子， 再与蛋白分子中的氨基反应，可形成

16、碳氮单键交联的产物。如 14溴代柔红霉素在微碱性条件可与蛋白 IgG 结合，形成抗体导向偶合物20。（五）巯基青霉烯酸分子上的巯基，可以与蛋白分子中引入的巯基反应，形成以二硫键交联的结合物。6, 0 溴孕酮及14溴代柔红霉素3可以与蛋白分子中引入的巯基反应形成以硫醚键连接的结合物。利用巯基反应进行偶联的方法主要用于蛋白毒素与抗体偶联，形成免疫毒素。一般来说，巯基可以通 过二硫交换反应形成二硫键，或通过与马来酰亚胺基上双键的加成反应形成硫醚键，实现毒素与蛋白的连 接。类似的交联方法同样可以用于制备酶标抗体。由于蛋白质分子中通常没有巯基反应活性基团，因此，巯基交换反应具有较好的选择性，在一定程度 上避免相同分子间的聚合，而且通过定量引进巯基及巯基反