测蛋白质含量方法

《测蛋白质含量方法》由会员分享，可在线阅读，更多相关《测蛋白质含量方法（5页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、蛋白质含量测量方法从查阅的资料来看，目前测定蛋白质含量常用的方法有凯氏定氮法、双缩脲 法(Biuret)、紫外吸收法、考马斯亮蓝法(Bradford)、Folin酚试剂法(Lowry )。 这五种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，每种方法都有其优缺 点，在选择方法时应考虑：实验对测定所要求的灵敏度和精确度；蛋白质的 性质；溶液中存在的干扰物质；测定所要花费的时间。一、凯氏定氮法1、实验原理蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解， 分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐 酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，

2、即为蛋白质含量。(1) 有机物中的胺根在强热和CuS04,浓H2S04作用下，硝化生成(NH4) 2S04 反应式为：CuSO4 +2NH2+H2S04+2H+=(NH4)2S04(2) 在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3，收集于H3BO3溶液中 反应式为:(NH4)2S04+2Na0H= 2NH3+2H2O+Na2SO42NH3+4H3B03=(NH4)2B407+5H20(3) 用已知浓度的H2SO4 (或HCI)标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量， 然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量反应式为：(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O=(NH4)2SO4+4H

3、3BO3 (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO32、操作方法(1) 样品处理：精密称取0.2-2.0g固体样品或2-5g半固体样品或吸取10-20ml液 体样品(约相当氮30-40mg),移入干燥的100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜， 6g 硫酸钾及 20 毫升硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以 45 度角斜支于有小孔 的石棉网上，小火加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内 液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热 0.5 小时。取下放冷，小心加 20ml 水，放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液

4、并入容量瓶中，再加水 至刻度，混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸同一方法做试剂空 白试验。(2) 按图装好定氮装置，于水蒸气发生器内装水约2/3处加甲基红指示剂数滴及数 毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热煮沸水蒸 气发生瓶内的水。(3) 向接收瓶内加入 10ml 2%硼酸溶液及混合指示剂 1 滴，并使冷凝管的下端插入 液面下，吸取10.0ml样品消化液由小玻璃杯流入反应室，并以10ml水洗涤小烧杯使流 入反应室内，塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞。将 10ml 40%氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯， 提起玻璃塞使其缓慢流入反应室，立即将玻璃盖塞紧，并加水于

5、小玻璃杯以防漏气。夹 紧螺旋夹，开始蒸馏，蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏 5min。 移动接收瓶，使冷凝管下端离开液皿，再蒸馏lmin，然后用少量水冲洗冷凝管下端外 部。取下接收瓶，以0.01N硫酸或0.01N盐酸标准溶液定至灰色或蓝紫色为终点。同 时吸取10.0ml试剂空白消化液按（3）操作。3、优点缺点凯氏定氮法适用范围广泛，测定结果准确,重现性好，但操作复杂费时,试剂消耗量大。二、双缩脲法（Biuret）1、实验原理双缩脲（NH3C0NHC0NH3 ）是两个分子脲经180 C左右加热，放出一个分子氨后得到 的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双

6、缩脲反应。凡具有两 个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能够以一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都 有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基 酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。2、操作方法（1）标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0， 0.2， 0.4， 0.6， 0.8， 1.0 毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后， 在室温（2025C ）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第 一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值 为纵座标绘制标准曲线。（2

7、）样品的测定：取23个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。 注意样品浓度不要超过 10mg/ml。3、优点缺点实验操作简便迅速，但其缺点是灵敏度较低,蛋白质量须在1 20mgPmL时测定结果 较准确。双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。三、紫外吸收法1、实验原理蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有 吸收紫外光的性质，吸收峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。 此外,蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液 的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。

8、2、操作方法取待测样品制成蛋白浓度大约在0. 11. 0mgPmL 的蛋白质溶液，用紫外分光光度 计进行比色，对照标准曲线得出样品含氮量。每个样品做3 次重复测定，取平均值。3、优点缺点紫外吸收法简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用。此法测定蛋白质 含量的准确度较差,干扰物质较多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋 白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质有一定的误差,故本法适于用测定与标准蛋 白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质, 会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表,再进行计算的方法加以适当的校正。 但是因为不同的蛋白质和

9、核酸的紫外吸收是不相同的,虽然经过校正,测定的结果还是 存在一定的误差。四、考马斯亮蓝法（ Bradford）1、实验原理Bradford 法是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。考马斯亮蓝是一种有机染 料，在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中与蛋白质的碱性氨基酸（ 特别是精氨酸）和 芳香族氨基酸残基结合后变为蓝色，其最大吸收波长从465 nm 变为595 nm, 蛋白质在 11 000 Mg范围内，蛋白质一色素结合物在595 nm波长下的吸光度与蛋白质含量成 正比,故可用于蛋白质的定量测定。2、操作方法（1） 标准曲线测定法分别取六只试管，其中一只加入1.0ml蒸馏水做空白，5只分别加入不同体积

10、的浓 度为100ug/ml牛血清清蛋白标准液，补充水到1.0ml。然后每只试管加入5.0ml考马 斯亮蓝G-250试剂，摇匀放置5min，在紫外-可见分光光度计595nm处测定吸光值。以 A595吸光值为纵坐标，牛血清清蛋白的ug数量为横坐标绘制标准曲线。具体操作见下 表。蛋白质标准曲线测定加样试剂 空白 1 2 3 4 5100ug/ml 牛血清清蛋白/ml 1.0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8牛血清清蛋白/ug 0 10 20 40 60 80去离子水/ml 0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2考马斯亮蓝 G-250 试剂/ml 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.

11、0吸光值 A595（2）蛋白样品配制浓度约100ug/ml的待测蛋白质溶液。取一只试管加入1.0ml蒸馏水做空 白， 一支加入0.5ml待测蛋白质溶液，补充水到1.0ml。然后每支试管加入5.0ml考马斯亮 蓝G-250试剂，摇匀放置5min后，在紫外-可见分光光度计595nm处测定吸光值。用测 得的吸光值从标准曲线上查得相当于牛血清清蛋白的ug数量，计算出待测蛋白质的含 量。 在标准蛋白质和蛋白质样品的测定时，为了减小误差，每一个浓度的蛋白质做 3 支平行管。（3）试剂配置a.牛血清清蛋白标准液 结晶牛血清清蛋白或酪蛋白，预先经微量凯氏定氮法标定 该蛋白质的百分含量或者根据牛血清清蛋白的消光

12、系数是6.6来计算其百分含量。然后根据该蛋白的纯度配置成浓度为100 ug/ml 的蛋白溶液。b.考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇，加入100ml质量浓度为0.85g/ml的磷酸， 作为母液保存，使用时用水稀释到1000ml。试剂的最终浓度为0.01%考马斯亮蓝G-250、 质量浓度为 0.085g/ml 磷酸。3、优点缺点该法方法简便,易于操作,所用试剂较少,显色剂易于配制。干扰物质少,如糖、缓 冲液、还原剂和络合剂等均不影响显色。此法的缺点是由于各种蛋白质中的精氨酸和芳 香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制 作标准曲线时通常选用Y -

13、球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差。五、Folin酚试剂法（Lowry）1、实验原理Folin-酚试剂法测定蛋白质含量是双缩脲法的发民，所用的试剂是由两部分组成 的。第一部分相当于双缩脲试剂，第二部分为Folin-酚试剂（磷钨酸和磷钼酸混合液）。 因此，反应的程序也是分两步进行的。第一步相当于双缩脲反应，在碱性条件下蛋白质 中的肽键与Cu2+作用生成络合物；第二步是基于Folin试剂（磷钼酸和磷钨酸试剂）在碱 性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原生成钼蓝和钨蓝混合物（呈蓝色反应）。由于 蛋白质中含有带酚羟基的酪氨酸，故有此呈色反应。而且溶液颜色的深浅与蛋白质的含 量成正比关系。此法也适用于

14、测定酪氨酸和色氨酸的含量。本法可测定范围是 25一250p g2、操作方法（1）标准曲线的测定取 16 支大试管， 1 支作空白， 3 支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0， 0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）。用水补足到 1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20 25C ）放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙（Folin酚试剂），同样立即混匀。这 一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质 溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸

15、光度值。以蛋白质的 量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制出标准曲线。注意：因 Lowry 反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第 1 支试管加入5 毫升试剂甲后，开始计时， 1 分钟后，第 2 支试管加入5 毫升试剂甲， 2 分钟后加第3支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试 管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第 3支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开始测定光吸 收。每分钟测一个样品。进行多试管操作时，为了防止出错，必须在实验记录本上预先画好下面的表格。表中 是每个试管要

16、加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。最下面两 排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。（2）样品的测定 取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20250微克），按上述方法进行操作，取1毫升 蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时 进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3 个试管。如上表中的8、9、10 试管。 根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的 蛋白质浓度。3、优点缺点优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多。缺点是费时间较长，要精确控制操作时间， 标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。而且，耗费时间长， 操作要严格计时，颜色深浅随不同蛋白质变化。