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1、word【实验目的】1、掌握碱变性提取质粒DNA法的原理、过程与各种试剂的作用。2、掌握凝胶电泳对DNA别离纯化的原理和方法。【实验原理】1、提取、纯化质粒DNA碱变性提取法提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB一氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进展。提取的质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定与分析。碱变性提取质粒DNA一般包括三个根本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；别离和纯化质粒DNA。在细菌细胞中，染色体DN
2、A以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达120的碱性溶液中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大局部氢键断裂，但两条互补链不完全别离。当用pH值46的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质一SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA别离。溶于上清液的质粒D
3、NA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNase A以与一些可溶性蛋白，可通过酚氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。2、琼脂糖凝胶电泳电泳electrophoresis)是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极方向移动的现象。各种生物大分子在一定条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因电离子的大小、形态与电荷量的不同而有差异。利用移动速
4、度差异，就可以区别各种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于别离、鉴定和纯化DNA片段，是分子生物学的核心技术之一。凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨X围极广。此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭(EB)或SYBR Gold染色直接观察到，甚至含量少至20 Pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。需要的话，这些别离的DNA条带可以从凝胶中回收，用于各种各样目的的实验。分子生物学实验中，常用的两种凝胶为琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶。这两种凝胶能灌制成各种形状、大小和孔径，也能以许多不同的构型和方位进展电泳。琼脂糖凝胶电泳易于操作，适用于核酸电泳，测定DNA的相对分子质量
5、，别离经限制酶水解的DNA片段，进一步纯化DNA等。琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基而带负电荷，在电场中向正极移动。DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移速率主要取决于下面6个因素：1)样品DNA分子的大小：电泳时，线性双螺旋DNA分子是以头尾位向前迁移的，其迁移速度与相对分子质量(所含碱基)的对数值成反比，这是因为大分子有更大的摩擦阻力。2)DNA分子的构象：相对分子质量一样而构象不同的DNA分子，其迁移速率不同。在抽提质粒DNA过程中，由于各种因素的影响，使超螺旋的共价闭合环状结构的质粒DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)的
6、一条链断裂，变成开环DNA(open circle DNA，oeDNA)分子，如果两条链发生断裂，就转变为线状DNA(1iner DNA，L DNA)分子。这三种构型的分子有不同的迁移率。一般情况下，超螺旋型迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的是开环状分子。3)琼脂糖浓度：琼脂糖浓度直接影响凝胶的孔径，一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的泳动速度不同。通常凝胶浓度越低，如此凝胶孔径越大，DNA电泳迁移速度越快，因此，相对分子质量越大，选用的凝胶浓度应越低。4)电泳所用电场：低电压条件下，线性DNA片段的迁移速率与所用电压成正比，电压越高，带电颗粒泳动越快，但随着电场强度的增加，不同长
7、度DNA泳动的增加程度不同，因此凝胶电泳别离DNA的有效X围随着电压上升而减少。为了获得DNA片段的最优别离效果，电场强度应小于5 Vcm。5)缓冲液：缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率。当电泳液为去离子水(如不慎误用去离子水配制凝胶)，溶液的导电性很少，带电颗粒泳动很慢，DNA几乎不移动；而在高离子强度下(如错用10电泳缓冲液)，导电性极高，带电颗粒泳动很快，产生大量的热，有时甚至熔化凝胶或使DNA变性。电泳时常用的缓冲液有乙酸盐TAE、硼酸盐TBE)和磷酸盐TPE几种不同的缓冲液，通常配制成10或5的浓度母液保存于室温下，用时稀释至工作浓度。TAE缓冲液缓冲能力弱，长时间电泳缓冲能力逐渐
8、丧失阳极变碱性，阴极变酸性，长时间电泳需要更换缓冲液。TAE缓冲液可以别离数KB长度的DNA，在精致DNA片段以与染色体DNA进展杂交时经常使用。 6)温度：琼脂糖凝胶电泳时，不同大小DNA片段的相对电泳迁移率在430内无变化，一般琼脂糖凝胶电泳多在室温下进展，而当琼脂糖含量少于05时，凝胶很脆弱，最好在4下电泳以增加凝胶强度。【实验仪器、材料与试剂】1、 仪器和材料接种环，培养皿，酒精灯，恒温振荡培养箱，高速冷冻离心机，漩涡振荡器，微量移液器与多型号枪头，微波炉，电泳仪等菌体： DH5受体菌，具有Ampr标记的质粒pUC19。Maker: /Hind III DNA Maker DL2000
9、 DNA Maker 点样对照组： pUC19/ Hind II双链线性DNA PUC19商品 DNA2、 实验试剂LB培养基，抗生素氨苄青霉素，溶液，溶液，溶液，3mol/L NaAc溶液，预冷无水乙醇，70%乙醇溶液，RNase A母液，TE缓冲液，饱和酚，氯仿/异戊醇混合液，酚/氯仿/异戊醇(PCI)混合液，TAE电泳缓冲液10，溴化乙锭EB)，上样缓冲液6。溶液：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0。(1M Tris-HCl，12.5ml pH 8.0；0.5M EDTA 10ml pH 8.0 ，葡萄糖4.730g，加ddH2O
10、至500ml。在121高压灭菌15min ，贮存于4)。溶液：0.2M NaOH，1% SDS。(使用前用10M的NaOH和10%的SDS母液配置，防止NaOH吸收空气中的H2O和CO2而减弱了碱性。溶液：5M醋酸钾KAc缓冲液60ml，冰醋酸11.5ml，重蒸水28.5ml，溶液中浓度K+3M,Ac-5M。【实验步骤】1、扩增质粒菌体培养 1在LB平板上划线培养具有Ampr标记的E.coli DH5菌，37恒温倒置培养16-18hr；之后，挑取单菌落，接种于20ml LB液体培养基含Ampr80ug/ml中，37，220rpm振荡培养过夜12-14hr；再转接一次，进展50或100倍稀释，同
11、样37，220rpm振荡培养4-6hr。2对50mL的离心管称重记为m1，取菌液30ml配平，6000rpm离心5min，弃去上清液；参加5ml溶液混匀，6000rpm离心5min,弃去上清液。取离心管称重记为m2)，可测得菌体重量W=m2-m1。2、提取质粒 1向离心管中参加溶液1.0ml/100mg菌体，漩涡混匀后，冰浴5min； 向离心管中参加溶液2.0ml/100mg菌体，轻柔颠倒混匀后，冰浴5min； 向离心管中参加溶液1.5ml/100mg菌体，轻柔颠倒混匀后，冰浴5min；离心管配平，12000rpm离心15min,取上清至新50ml离心管记体积为v1) 2参加2v1冰乙醇，颠倒
12、混匀，-20保存30min，12000rpm离心15min,弃上清液,将离心管倒置于纸巾上，以使所有液体流出。向沉淀中参加5mL70%乙醇进展洗涤，12000rpm离心2min,弃去上清液，重复洗涤一次； 37下保存5min,至离心管内枯燥，参加1mlTE缓冲液溶解，得粗提物，将粗提物转移至新EP管，参加100ugRNase A10ug/ul),将EP管放置于37下，保温1-2小时。3、 纯化质粒 1将提取物等分为500ul置于EP管中，加等体积酚液，混匀后，12000r离心5min,将上清液转移至新EP管；参加等体积酚/氯仿/异戊醇(PCI)混合液，混匀后，12000rpm离心5min,转上
13、清至新EP管；参加等体积氯仿/异戊醇混合液，混匀后，12000rpm离心5min,将上清液转移至新EP管； 2参加1/10体积的3mol/L NaAc，混匀后，参加2倍体积包括上清液和1/10体积的NaAc)的冰乙醇，颠倒混匀，-20保存30min，12000rpm离心15min,弃去上清液；参加5mL70%乙醇进展洗涤，12000rpm离心2min,弃去上清液，重复洗涤一次； 37下保存5min,至沉淀枯燥,每管参加25ul TE溶液,温和振荡几秒钟，至沉淀溶解。将2管整合到一管，得到50ul质粒DNA组，放置-20下保存。4、凝胶电泳别离质粒 1制胶：1% 琼脂糖凝胶：称取0.4g琼脂糖于
14、300ml三角烧瓶中，加40ml 1TAE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60左右，三角瓶放在手面可坚持1min即可，缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中电泳缓冲液1TAE，即可上样。l上样缓冲液，混合，进展点样。点样完毕后，100V，200mA条件下电泳30min。电泳完毕后，进展EB染色，用凝胶成像仪拍照，得到实验结果。【须知事项】1、在接菌时，注意无菌操作，物品应在酒精灯火焰上方无菌区域内。将挑有菌体的接种环在三角瓶壁上轻轻接触，然后轻轻摇动三角瓶，让液体的LB培养基轻轻冲刷菌体，当观察到附近的LB培养基有轻微浑浊现象时，接菌成功，再
15、轻轻震荡三角瓶，使全部菌体进入培养基中。2、注意离心机的使用，离心管要配平，以防错误操作损坏离心机。离心完毕后，将离心管从离心机取出时应保持其倾斜状态，防止沉淀重新进入上清液中。3、为获得高纯度质粒DNA，必须彻底除去杂蛋白、染色体DNA和RNA。在整个提取过程中出去染色体DNA的关键步骤是参加溶液、溶液的变性和复性环节，应控制好变形和复兴的时机。参加溶液时，可剧烈震荡，使菌体沉淀转变成均匀的菌悬液，此时细胞尚未破裂，染色体不会断裂；参加溶液时，菌液变粘稠、透明，无菌块残留；参加溶液时，会立即出现白色沉淀。参加溶液和溶液后，应缓慢上下颠倒离心管数次，切忌在漩涡振荡器上剧烈震荡，否如此，染色体DNA会断裂成小片段，不会形成沉淀，而溶解在溶液中，与质粒DNA混合在一起，不利于质粒DNA提纯。因此，操作时一定要缓慢柔和，采用上下颠倒的方法，既要使试剂与染色体DNA充分作用，又不破坏染色体的结构。4、酚具有腐蚀性，能损伤皮肤和衣物，使用时应小心。皮肤如不小心沾到酚，应立即用碱性溶液、肥皂或大量清水冲洗。5、沉淀DNA通常使用预冷无水乙醇，在低温条件下长时间放置可使DNA沉淀完全。除用乙醇沉淀DNA外，还可使用06倍体积的异丙醇，但异丙醇也能将盐等杂质沉淀，所以沉淀需要在常温下进展，并且时间不宜
