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1、农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞实验步骤整理人：早熟组赵凤利一、准备试剂：1. 加有三抗的YEB 或 LB 液体培养基，用于摇菌；2.渗透液(50ml) : 250mg D-glucose, 5ml MES 原液，5ml Na3P0412H2O 原液，5ul 1M 乙酰丁香酮原 液，加 dH2O 至 50ml。1) . 500 mM MES (Sigma) ： g 溶于 50ml dH 20，保存于42) . 20 mM Na 3P04 12H2O (BDH) : g 溶于 50ml dH 2O,保存于 4 c3) . 1M 乙酰丁香酮： g,力口 DMSO至1 ml,可分装成小剂量，存于 -20
2、C。二、实验步骤：1. 将检测成功的农杆菌菌液过夜扩摇，28 ,200rpm；2. 取 ml 菌液，加到灭菌的离心管中；3. 1000 g, 10 min,沉淀菌体(室温)，去上清，加1 ml渗透液，悬浮菌体；4. 重复步骤3，进一步除去少量的抗生素；5. 取少量悬浮菌液稀释10 倍，测定0D600 值，并乘以10，作为悬浮菌液的0D 600值；注：如果悬浮菌液的0D 600值在之间，说明有大量的死菌细胞，将降低转化的效率。6. 确定悬浮菌液对渗透液的滴定度，计算稀释系数，使最终悬浮菌液(用于侵染)为 ml， 0D 600为，通常ml 的最终悬浮菌液就能满足侵染了；如：需要。口600=的500
3、 ul最终悬浮菌液，而测定的悬浮菌液的OD600=,则最终悬浮菌液中，悬浮菌液的用量为*500)/=125 ul ，则需要渗透液为375 ul。7. 在离心管中，配好最终悬浮菌液，准备侵染；8. 侵染前，将烟草放于白色荧光灯下1 h ，使其气孔打开；9. 选择倒三叶和倒四叶，用于侵染(于两叶脉之间侵染)，一株选两叶，侵染一种菌液；10. 用去掉针头的注射器，轻柔地摩擦待转叶片的背部cm2),或用小针头刺穿，以去除其蜡质层；11. 侵染前，用记号笔标记待转区域；12. 将第 7 步中的最终悬浮菌液吸入1ml 去针头的注射器中13. 将注射器对着叶片背面的待转区域，一手按着叶片上面，另一手轻轻推动活塞，直到看到液体扩散，再侵染其他部位，侵染后，用记号笔圈定侵染区域；14. 将侵染后的烟草放回培养室15. 2-3 天后：1) . 亚细胞定位实验：切掉侵染区域，制片，荧光显微镜观察；2) . 启动子 GUS 活性： GUS 染色， 75%酒精脱色，观察结果。参考文献：Nature Protocols, 2006: 2019-2025.
