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1、请下载支持！芈莂蚄袆膇蚂芅 SCGE法检测 DNA损伤蕿薃莇荿袈膃羅 SCGE的原理（中性电泳液，高盐和变性剂检测 双链断裂；碱性检测单链，双链断裂和碱不稳定性）蒁薄膈荿羂蒅膇 SCGE技术是一种在单细胞水平上检测有核细胞 DNA损伤和修复的方法。该技术的原理是基于有核细胞的 DNA分子量很大， DNA超螺旋结构附着在核基质中，用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载玻片上，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜及其它生物膜破坏，使细胞内的 RNA、蛋白质及其它成分进入凝胶，继而扩散到裂解液中，唯独核 DNA仍保持缠绕的环区 (Loop) 附着在剩余的核骨架上， 并留在原位。如果细胞未受损伤， 电泳中核 DNA因
2、其分子量大停留在核基质中， 经荧光染色后呈现圆形的荧光团，无拖尾现象。肄肇袀袁羆芀聿 若细胞受损， 在中性电泳液 (pH8) 中，核 DNA仍保持双螺旋结构， 偶有单链断裂 (SSBs)并不影响 DNA双螺旋大分子的连续性。 只有当 DNA双链断裂 (DSBs) 时，其断片进入凝胶中， 电泳时断片向阳极迁移， 形成荧光拖尾现象， 形似彗星。如果在碱性电泳液 (pH13)中，先是 DNA双链解螺旋且碱变性为单链，单链断裂的碎片分子量小即可进入凝胶中，在电泳时断链或碎片离开核 DNA向阳极迁移，形成拖尾。细胞核 DNA受损愈重， 产生的断链或碱易变性断片就愈多， 其断链或断片也就愈小， 在电场作用
3、下迁移的 DNA量多，迁移的距离长， 表现为尾长增加和尾部荧光强度增强。 因此，通过测定 DNA迁移部分的 光密度或迁移长度 就可定量测定单个细胞 DNA损伤程度。袆莁羄蒇肈薀薄 1.仪器及试剂袁袂蚄羇肁莃薅 冰箱，载玻片，水平电泳槽，荧光显微镜。蚁膄螆薂节肆羈 不含 Ca2+、 Mg2+的PBS (PH=7.4)；正常溶点琼脂糖（ NMA ）及低溶点琼脂糖（LMA ）（0.6溶于 PBS）；细胞裂解液（ 2.5M NaCl, 100mM Na 2EDTA, 10mMTris-HCl,1% 肌 氨 酸 钠 ,PH=10,用前 加 1 TritonX-100,10% 二 甲 亚砜（ DMSO）；
4、电泳缓冲液（ 0.3M NaOH, 1mM Na 2EDTA, PH=13）；0.4M Tris-HCl（ PH=7.5）；无水乙醇； 20-30 g/mL 溴化乙锭（ EB）。蚅罿螈莄薇袇节 2.方法螇艿芃螃螆蕿螄 1. 在体外实验中 , 将对数期生长的细胞用0.25%胰蛋白酶消化 , 收集细胞备用。在体内实验中 , 取需测试的脏器或组织 , 用磷酸缓冲液 ( PBS,PH7.4)洗净后 , 剪至糜状滴加 PBS(PH7.4) 研磨 , 过 300 目筛子 , 收集细胞 , 悬浮于 PBS(PH7.4)中 , 细胞密度为（ 1-5 ） x 104-6 个/ mL （血细胞计数板最中央每小格0
5、.5 个细胞） , 台盼蓝染色、镜检、细胞存活率 90 %以上 , 即可进行以下操作。螀肂芄衿罿蚃肆膅蚅蚇蒀蒁薇蚆2. 样品处理：1）通过尾动脉取血，肝素或枸椽酸钠抗凝，800r/min 离心 5min，加等体积无钙镁磷酸缓冲液，获得细胞悬液。膆薆羁蚄袃蝿芁 a. 枸椽酸钠抗凝 : 有2Na3C6H5O7。和 2Na3C6H5 11H2O等多种晶体。通常用前者配成 109mmol/l(32g/l) 水溶液（也有用 106mmol/l 浓度），与血液按 1：9或1：4比例使用。枸椽钠对凝血 V因子有较好的保护作用。虿蒂蒃芄薈螁肃 b. 肝素（ heparin ）每毫升血液抗凝需要持素152.5I
6、u.请下载支持！蚈莂螅蒆节袂蚆 c.EDTA盐经 1000C烘干，抗凝作用不变，通常配成 15g/L 水溶液，每瓶 0.4ml ，干燥后可抗凝 5ml 血液。 EDTA盐对红、白细胞形态影响很小 .蒄芆蕿葿螁袃薈 2）过氧化氢处理：细胞悬液分成两份 :A 份 1ml； B 份 0.9ml 。 B 份里再加 0.1ml 5mmol的过氧化氢，混匀。全部冰浴 1 小时。完后检测细胞存活率 ( 台盼蓝染色、镜检 ) ( 过氧化氢处理用于检测 DNA交联 ) 。螆蒈羀袄莄莆腿 3）应用细胞悬液制备： 4 度下，1000r/min 离心 5 分钟。去上清，加 PBS(PH 7.4) 。每份制作 2 片凝
7、胶。芇莀螂袅葿蚀芃 3.制胶袁薁莅莈膁膂芇 将载玻片用砂纸 ( 粒度 No. 380) 磨出痕迹 ,以便凝胶附着 .将37C正2+2+常溶点 0.6 琼脂糖液（溶于不含 Ca 、 Mg 的 PBS，需要沸水加热） 75-100 l 铺展到预热的磨痕载玻片上，作为第一层凝胶，盖上盖玻片 4凝固 10分钟以上 , 去掉盖玻片后加入制备的细胞悬液 85l(10 l 含1000 个细胞的 PBS和75 l 0.6% 的低熔点琼脂糖 (LMA) 在 37混匀 ) 铺展到载玻片上作为第二层 , 4 至少 10分钟 , 凝固后再铺展低溶点 0.6 琼脂糖 100 l 作为第三层 , 使载玻片上琼脂糖呈“三夹
8、层 ”式 .蚄袆膇蚂芅蒄荿 （注意： NMA适宜浓度 0. 5 % 1 % , 过高或过低将造成凝固速度过快而不易铺平或粘着力低而脱落 , 铺胶前载玻片预热 , 有利于铺植平整。 LMA 凝胶浓度直接关系到 DNA 迁移长度 , 0. 6 % 较适宜。第3 层LMA 可不铺。微量加样器吸头前端残留凝胶勿吹出 , 以防形成气泡。移去盖玻片时注意勿损伤胶膜）莇荿袈膃羅芈莂 4.裂解膈荿羂蒅膇蕿薃 4凝固后去掉盖玻片，将载玻片浸人新配制的 4预冷细胞裂解液（含 2.5M NaCl, 100mM Na2EDTA, 10mM Tris-HCl(PH=10)，用前加 1 TritonX-100,10% 二
9、甲亚砜（DMSO），裂解不少于 1h。此步骤的目的即是溶解细胞膜及核膜 , 除去蛋白质、 RNA 等, 仅存留核骨架。袀袁羆芀聿蒁薄 5.电泳羄蒇肈薀薄肄肇裂解后将玻片晾干，并列置于水平电泳槽的阳极端，电泳缓冲液(0.3M NaOH、1mM EDTA)盖过胶面约 2.5mm，静置 20-60min 解链。之后接通电源，电泳条件 25V，300mA，时间 20-40 分钟。通过调节液面来调电压。( 电压先调到最大，电流 300mA然后通过液面来调节电压) 。蚄羇肁莃薅袆莁 （注意：电泳时电压、 电流及时间的长短会直接影响 DNA迁移长度 , 造成假阳性或假阴性。文献报道为 1850 V ,200
10、300 mA ,2040 min。我们采用 25 V ,300 mA ,20min , 效果良好。电泳进行中应持续监测 , 吸出或加入电泳液 , 调节液面高度 , 保持电压与电流的恒定）螆薂节肆羈袁袂 6，染色螈莄薇袇节蚁膄 电泳结束后，用 0.4M Tris-HCl (PH 7.5) 洗涤三次，每次 5 分钟，呈中性后，凉干玻片， (无水乙醇处理 30 分钟可增加荧光强度 ) 每片滴加 50l 20-30 gml 的 EB染色 15 20min，然后用蒸馏水洗滴，盖上盖玻片在荧光显微镜下观察。 24 小时内检测，时间过长将导致荧光褪色。芃螃螆蕿螄蚅罿 （注意：可在染色后 4 避光潮湿条件下保
11、存 , 数日后观察。 但我们通过实践得出为防止荧光衰减 , 尽快阅片较好。阅片过程中 , 由于淬灭效应 , 荧光减弱很快 , 因此操作必须紧凑。结果可直接在荧光显微镜下分析 , 或先摄影 , 再进行照请下载支持！片分析。但摄影、相片冲洗条件等较难控制统一, 因此应尽量直接分析）芄衿罿蚃肆螇艿 以上除中和及染色外，各步均应在 暗处进行，以避免额外的DNA损伤。应尽快阅片，时间过长将导致荧光褪色。蚇蒀蒁薇蚆螀肂 6观察羁蚄袃蝿芁膅蚅使用 100W汞灯作为荧光光源，在荧光显微镜（激发波长为549nm,发射波长为 590nm）下，损伤的细胞 DNA呈现由圆形、致密红色核心（慧头）和朝向阳极的尾端 DN
12、A碎片（慧尾）构成的“慧星”。 本实验选用 DNA断裂分级和DNA慧星尾长两种观察指标。蒃芄薈螁肃膆薆 DNA断裂分级按慧星尾部占全部 DNA量的比例判断。 0 级：无断裂级损伤； A 级：轻度断裂损伤，断裂损伤 10%；B 级：中度断裂损伤，断裂损伤10%-20%；C 级：重度断裂损伤，断裂损伤 60% “慧星” , 每片随机计数 50 个“慧星”，计算各级所占比例。螅蒆节袂蚆虿蒂 DNA慧星尾长是在高倍镜下直接测量出“慧头”中心到“慧尾”的长度 ( 格数 ) 。每片随机测量 25个“慧星”尾长 , 计算均数。蕿葿螁袃薈蚈莂 7统计分析： 应用 SPSS软件分别对彗星尾长和断裂进行方差分析和
13、卡平方检验。羀袄莄莆腿蒄芆 表一：螂袅葿蚀芃螆蒈 编号莅莈膁膂芇芇莀 DNA 断裂损伤分级袈膃羅芈莂蚄袆 0羂蒅膇蕿薃莇荿 A羆芀聿蒁薄膈荿 B 肈薀薄肄肇袀袁 C 肁莃薅袆莁羄蒇 D节肆羈袁袂蚄羇薇袇节蚁膄螆薂螆蕿螄蚅罿螈莄罿蚃肆螇艿芃螃蒁薇蚆螀肂芄衿袃蝿芁膅蚅蚇蒀 表二：薈螁肃膆薆羁蚄 编号节袂蚆虿蒂蒃芄 尾长螁袃薈蚈莂螅蒆头直莄莆腿蒄芆蕿葿下降径率葿蚀芃螆蒈羀袄膁膂芇芇莀螂袅芅蒄荿袁薁莅莈羅芈莂蚄袆膇蚂膇蕿薃莇荿袈膃 预期结果：污染越严重， 随着 DNA 链受损程度越大 , 出现慧尾的细胞数越多，慧星尾中的 DNA 含量及尾长也就增加。聿蒁薄膈荿羂蒅 单细胞凝胶电泳技术在军事毒理学中的应
14、用作者：张慧丽余卫 闫长会2003-9-2由 Ostling 和 Jonhanson首先提出，后又经 Singh 和 Olive 建立和改进的单细胞凝胶电泳 (Single Cell Gel Electrophoresis，简称 SCGE)技术，因其细胞电泳形状颇似慧星，又称慧星试验 (Comet Assay)。它是一种测定和研究单个细胞 DNA 链断裂的新电泳技术，与传统方法相比，其简便、快速、灵敏、样品量少、无需放射性标记，具有极高的实用价值。该技术可用于体内、体外各种实验，目前已广泛地应用于各种有核细胞经受试物诱导的 DNA 损伤和修复的研究。 在国外，SCGE被用于遗传毒理学、放射生物学、环境生物监测、药物筛选、肿瘤发病机理及诊断与治疗、衰老和细胞凋亡机制的研究等， 正在形成一个新的研究领域， 有关应用该技术的报告也是逐年增加 1，2。然而，国内关于该技术的研究报告仅有几篇。本文就该技术的原理、 操作程序和方法作一简介， 并预测其在军事毒理学研究中将有广阔的应用前景。1 SCGE 的原理请下载支持！SCGE 技术是一种在单细胞水平上检测有核细胞 DNA 损伤和修复的方法。该技术的原理是基于有核细胞的 DNA 分子量很大， DNA 超螺旋结构附着在核基质中，用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载玻片上
