REACH法规 第四卷译稿-15

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1、B。12. 诱变（性)体外哺乳动物红血球测定 方法这一个方法是经济合作暨发展组织 T 74 的哺乳动物红血球微核 测定复制(99）.1。1。 引言活的哺乳动物体内的微核测定用来发现对测定成分感应的的染色体有核红细胞的有丝分裂的物种如骨髓所抽取样品的红血球和/或 外围设备动物的血球通常是啮齿动物老鼠。微核测定的目的要识别造成细胞生成的损害的物质是哪一部分造成的.微核的形成包含滞后的染色体碎片或整个的染色体。当骨髓有核红细胞进入一个多色的红血内发展的时候,主要部份被挤出；任何的微核已经被形成可能留在后面以别的方式收集细胞质微核在这些细胞中被促进因为它们缺乏一个主要的核心。微核的频率增加的动物多色的

2、红血球感应染色体的损害.老鼠的骨髓自多色的红血球以后通常被用于这一个测定。 不成熟的微核的测量 （多色的)周边的血红血球相等地是可接受的在任何的物种方面在无能要除去微核红血球的脾脏已经被示范，或已经显示一个合适的急性因素结构的或数字的染色体变异。微核可能被许多的标准区别。 包括着丝点或微核中的着丝点DNA的出现确认或缺少。 微核的频率不成熟的 （多色的）红血球是那主要的端点。外围设备的成熟 (正常染色质的） 红血球的数字也包含在成熟的红血球的一个给定的数字之中的 微核的血可能被用如测定的端点，当动物不断地被对待达4个星期之久的时候或更多。活体体内微核测定的这一个哺乳动物尤其是与估定有关导致有机

3、体突变的物质它允许考虑 活体新陈代谢的因素，药物动力学的危险和DNA修理处理虽然这些可能在物种之中改变遗传基因的端点。在活体测定中进一步的调查是也有用的。在体外系统中一导致有机体突变的物质被发现。如果有证据测定物质 ，或一个没有活性的新陈代谢产物,将不达到目标,使用这一个测定是不合适的。一般引言在部份 B 。.2 定义着丝点（inochore): 是染色体上的一个区域，是细胞分裂时纺锤体连接的地方，从而允许姊妹染色单体有序的运动到子细胞中.一个染色体的区域 (s） 由于纤维是在细胞区分期间联合, 允许染色体的有秩序的运动到那细胞的杆。微核： 小的核, 分开和附加的到细胞的主要核,在有丝分裂末期

4、有染色单体或整个染色体形成染色体碎片或全部的有丝分裂 (减数分裂） 的末期时候的染色体。正常染色质的红血球: 成熟的红血球缺乏醋栗核蛋白质核糖体并且能够通过核糖体染色和未成熟的正常的红细胞区分开来。而且可能是不成熟的, 多色的红血球对醋栗核蛋白质是选择的。多色的红血球多染性红细胞: 不成熟的红血球红细胞，是红细胞形成中的一种状态,发展的一个中间的阶段，仍然含有核糖体包含醋栗核蛋白质因此可能可以和成熟的红细胞区分开来被区别从成熟的， 正常染色质藉着对醋栗核蛋白质是选择的污染红血球。1。3. 测定方法的原则原理动物藉着一条合适的路径接受测定物质。 如果骨髓被用，那动物在治疗测试合适的时侯被宰杀,

5、吸取骨髓吸取，和制造而且沾染准备制备和染色（1）(2)(3)（4)（)(6) 。 (） 当pphal bood外围设备血被用的时候,血在治疗测试开始后合适的时侯被收集并且准备被做而且标记（4)(8)(9）。(0） 因为和周边的血用with eriprl lo研究，尽可能在最后一次接触药品和细胞收集中间尽可能短的时间内收集血液一点的时间应该逝去在最后接触和细胞收获之间。分析配制品验证微核的存在准备出现分析微核。1。. 测定方法的描述1。1. 准备1.4.1。1动物物种的选择如果使用骨髓被用，推荐使用老鼠小鼠或大鼠被的推荐,虽然任何的适当哺乳动物物种可能被用。 当血被用作外围设备体外进行血液测试时

6、，推荐使用小鼠，老鼠被推荐. 然而，任何的合适的哺乳动物的物种可能被用。但是一个物种作为提供一脾脏不除去微核红血球或一个已经显示合适的急性物种发现引起染色体在结构的或数目上发生字的染色体变异。 实验室普遍通常使用的过年轻的健康动物的实验室应该可以被使用。在研究中， 各性别动物的重量变化应该是最小的并且不超过 2。1。41.2. 居住和饲养情况常用条件参考总引言一般的情况要分开, 引言指的是的应用的尽管目标时，湿度气应该是 50-60%.1.4。1.3动物的准备健康的年轻成年的动物任意随机地被指定为对照组和治疗团体测试组。实验那些动物进行了个体的确认独特地被识别。动物对适应实验室的新环境至少为五

7、天. 应该采取特殊的方法笼应该被安排特殊的方法以致于使关进笼内动物可能产生的影响尽可能的作用被减少.1。.1.4. 剂量试剂的准备固体测定物质应该在合适的溶剂或介质中被溶解或稀释，如果合适的,在选配动物之前。 液体测定物质需被直接配制或在稀释之后配。 测定物质需及时准备，除非数据的稳定性可以显示储存的可行性.1.4. 测定情况测试条件1.4。.1。溶剂/介质溶剂 介质在剂量水平下不应该产生毒性作用, 而且不应该是和测定物质起化学反应。 如果除了众所周知的溶剂 介质被用，它们应该由数据支持它们的兼容性。如果被推荐无论那里都可以，这样的溶剂/ 介质首先应该被考虑.1.。22 对照组条件并发的同时进

8、行的阳性的和阴性(溶剂/介质）的对照组应该在每个测定中包括每种性别在内。除了处理测定物质,对照组团体的动物应该是以同一的方式处理。阳性的对照组应该被选用一边有清晰的作用但是并不一定可以立即向读者展现密码的特征。以一条不同的路径管理对照组阳性的结果并且只进行单一的取样是可接受地 。当可得的时候化学的班级使用相关阳性的对照组化学药品应被考虑到。包括物质的阳性对照组的例子：物质cas号码EINES号码甲磺酸乙酯0-205367乙基亚硝基脲7573921272丝裂霉素C007720-008-6环磷酰胺一水环磷酰胺58-00519200014替姆5132000835溶剂或介质单独处理的阴性的对照组, 应

9、该在每个取样的时候被用到,除非在组里被相同的方式处理过.从历史的对照组数据动物易变和频率是可得的。 如果单一抽取样品被申请阴性的对照组,大部分合适的时间是第一抽取样品时间。 除此之外，除非有历史的或出版了对照组数据示范在藉着被选择的溶剂/介质感应，没有有害的或诱导有机体突变的物质作用,未经处理的对照组也应该被用。如果血被用的外围设备，前治疗样品也可能是可接受如一个并发事件阴性对照组, 当产生的数据为历史的对照组是在预期的范围中，只有在短周边的血研究中(例如,-3 治疗 （s)可用。15。 实验步骤51。 动物的数量和性别每个治疗测试和对照组团体一定必需至少包括每性别 5只 动物。 如果在研究那

10、里的时间是从相同的物物种研究得到的数据而且使用相同的标准的接触路径测试,在毒性中和性别上没有实质上的不同，然后在单一性别方面尝试将会是充份允许的.对人类对化学药品接触的人类接触可能是有性别不同的差异的。例如和一些药学的代理人物制剂，测定就需要选用适当性别的动物进行测试应该是在适当性别的动物上施行.1。5.2. 治疗时间表 没有标准的治疗时间表测试程序 (也就是 1， 或较多的治疗测试以在 24个h间隔内）可推荐.只要实在作用为这一项研究已经被示范或为一项阴性的研究,来自广大的剂量样品摄生是可接受的， 像毒性一样的常被示范,否则界限剂量已经被使用， 而且配制继续的直到抽取样品。测定物质也可能被提

11、供如一份分散的剂量，也就是，二次治疗被只达几个小时分开,促进管理大体积材料。测定以下方式被运行测试可用如下两种方法进行:(一) 动物与测定物质一次一起对待. 骨髓的样品被拿至少两次， 开始必治疗后 4个小时， 但是使用抽取样品比 早过24个小时的治疗被证明之后,不扩充超过治疗后 4个小时以在样品之间的适当间隔.样品周边的血至少被拿抽两次， 开始在治疗过程中不早于36个小时,藉由在第一个样品之后的适当间隔， 但是不扩充超过 72个小时.当一个阳性的回应在一点钟被辨认出抽取样品时间的时候，附加的抽取样品不被需要。(二) 如果 2 或更多的每日日常的治疗被用测试被进行（例如 二次或较多的治疗测试在

12、24个小时间隔内）, 样品在8和 24小时 之间应该是收集一次小时,在那之后最后的治疗为骨髓和一次在 6 和8 小时之后为外围设备血的最后治疗测试(2） 当有关的时候，其他的抽取样品可被用于附加。需要的时候可能应用其他有关取样时间。1.5.3 剂量标准水平如果是因为没有合适的数据来而进行判定测定，在主要的研究中，应该是在相同的实验室中,使用相同的种类,菌种种属,性别和治疗作息制度测试程序。 （13） 如果测毒性性,三个剂量水平作为第一抽取样品时间。 这些剂量标准的范围从最大到很小或甚至没有毒性性.在比较迟的只有抽取样品时间最高的剂量需要到被用到. 最高的剂量是定义如被产生毒性的告示剂量以致于比

13、较高度的剂量甚至致命。 具有生物学活性的特殊物质在低毒或无毒的剂量 （ 如此的如荷尔蒙和细胞分裂素） 可能是这些剂量中的一些例外.我们应该设定一个标准，而且应该在个案基础上来评估。 最高剂量也可定义为一份剂量生产品骨头髓的毒性指示 (例如，骨头的骨髓和周围血液中的不成熟的红血球在总红血球之中比例的减少）。1。5。 极限测定如果一个测定以至少2000毫克/公斤身体重量的剂量水平作治疗测试，或是当作在同一天中的两个疗程。没有观察得出的毒性作用的生产品, 而且如果毒性物质不是预期的基于相关数据的物质， 那么，三个剂量水平的完全测定就是没有必要的了.因为经过较长时间的研究，那界限剂量是达到 1 天的治

14、疗2000毫克/公斤/身体重量/日子,100毫克/公斤/身体重量/ 日子治疗时间要超过1 天。 估计人类要接触出在极限测定中会使用较高的剂量标准。15。5. 剂量的管理测定物质通常用填喂法提供使用胃管或一合适的插管套管或腹膜内的注射。其他的显而易见的途径如果是正确的也是可以接受的.被测液体一次能注入的最大的体积主要仰赖测定动物的大小.最大体积不应该超过 2毫升/10/身体重量.比这些更大的体积的使用必须被证明.除了正常状态时，高浓度集中是具有加速破坏性质的刺激性的或腐蚀性的物质，易变的测定体积应该调整，使其集中以确保在所有的剂量水平是一个确定的常数。5。 去骨髓 /血的准备骨髓细胞通常从下列各

15、项祭品屠宰品中的大腿骨或胫骨中获得。一般而言，从大腿骨或胫骨中得到的细胞，准备而且沾染使用确定的方法。外围血从在后面的静脉血管或其他的合适的脉管获得。DNA特殊技术 比如,吖啶橙（14） 或 oehs3325 多 pyroinY（15） 能除去一些与使用有关的人工品的非DN 特性污染。这一优势不预先排除传统的污染使用 (例如，Gies）. 一些附加的系统，这些系统已经被确定为能充分的为实验室工作的微核 例如 纤维素除去有核的细胞 （16) 能也被用。1.5.7. 分析不成熟红细胞在总红细胞中所占的比例， 对每只动物来说， 至少应该数 00个骨髓红细胞和 1000为周边的红细胞（17）来决定。 所有的玻片（包括有正结果阳性的和阴性的负结果的所有样品）都应该在用显微镜分析之前分别编码。不成熟的微核红细胞由每个动物至少有20 不成熟的红细胞来刻划。将成熟的红细胞视为微核可以获得额外的信息.当分析玻片的时候，在总红细胞中, 不成熟的红细胞所占比例不应该比总样品数的20%少。 当动物在4个或更多的星期中不断地被施以疗法时， 每个动物至少有000个成