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1、吡格列酮对 3T3-L1 脂肪细胞中脂肪甘油三酯水解酶(ATGL )表达的影响朱欣娜，陈峻叡，许伟榕*(指导老师)(上海交通大学医学院 08 级留学生临床医学 5年制，*上海交通大学医学院实验教学中心，上海，200025)摘要：目的 初步探讨胰岛素增敏剂 -吡格列酮对于脂肪细胞中脂肪酶 ATGL 与 HSL 表达调控的影响 方法 首先，对 3T3-L1 前脂肪细胞进行诱导分化。细 胞分化成熟后，加入不同浓度吡格列酮刺激，寻找最优刺激浓度。之后，在不 同的时间点抽提其 RNA 与蛋白质，运用 RT-PCR 和 Western Blot 技术，从核 酸和蛋白质水平上检测ATGL与HSL的表达。结果
2、成功得到分化成熟脂肪细 胞，找到最优匹格列酮刺激浓度，RT-PCR及Western Blot结果显示吡格列酮 对ATGL与HSL的表达有一定上调作用，其表达变化呈现一定时间依赖性。【关键词】ATGL，3T3-L1脂肪细胞，吡格列酮，HSL,2型糖尿病The influence of pioglitazone on the expression ofadipose triglyceride lipase(ATGL) in 3T3-L1 adipocytesSheena CHOO, CHEN Chun-Jui, *XU Wei Rong(Shanghai Jiao Tong University
3、School of Medicine, *Experimental EducationCenter, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, 200025, China)【Abstract】 : Adipose triglyceride lipase (ATGL) is a recently identified enzyme in adipose tissue triacylglycerol catabolism. Studies showed that ATGL and HSL protein expression is decreased in
4、the obese and insulinresistant state (type 2 diabetes). Genetic variations within the ATGL gene in human also indicate a possibility of increased risk for type 2 diabetes. Thus, there might be a close correlation between ATGL and type 2 diabetes. Objective To study the influence of insulin sensitize
5、r- pioglitazone on the regulations of ATGL and HSL lipase in 3T3-L1 adipocytes in attempt to discover novel methods treating obesity and type 2 diabetes. Pioglitazone is a commonly used drug for the treatment of type 2 diabetes. Methods 3T3-L1 cell line were chosen and induced to differentiate into
6、mature adipocytes. When the cells are fully differentiated, add in pioglitazone of different concentration to stimulate in order to find out the optimal stimulus continuum. An optimum concentration 100umol/L of pioglitazone was chosen to treat the adipocytes. Then, cells were harvested at 24hrs, 48h
7、rs and 72hrs post treatment with pioglitazone. The harvested cells then have undergone RT-PCR and Western Blots to detect changes in the levels of ATGL and HSL nucleic acid as well as protein expression. Results Successfully obtained fully differentiated 3T3-L1 adipocytes, found the optimal stimulus
8、 continuum of pioglitazone. Results obtained from RT-PCR and Western Blots showed that pioglitazone has a time dependent impact towards ATGL and HSL expression. The presence of pioglitazone can slightly increase the expression of ATGL and HSL in 3T3-L1 adipocytes.【Key Words】ATGL, 3T3-L1 adipocytes,
9、pioglitazone, HSL, Type 2 diabetes引言:脂肪甘油三酯水解酶(ATGL, Adipocyte Triglyceride Lipase )是近年来发 现的一个新的脂肪代谢水解酶。众所皆知脊椎动物主要是以甘油三酯 (triglyceride , TG )的形式将能量储存于脂肪细胞的脂滴中，当机体需要能量 时， 便将甘油三 酯水解 成游离的脂肪酸( free fatty acid， FFA) 和甘油 (glycerol )。长期以来，激素敏感脂肪酶(hormone sensitive lipase , HSL)被 认为是脂肪分解主要限速酶。近来研究发现 HSL 基因敲
10、除小鼠体重未见异常增 加和脂肪量减少, 且保留了基础和异丙肾上腺素刺激下脂肪分解的能力, 基因敲 除小鼠出现脂肪细胞内甘油二酯( diacylglyceride, DG) 堆积。也有研究发现 HSL 与甘油二酯作用的特异活性是其与甘油三醋的十倍，提示可能存在其它甘 油三醋脂肪酶。2004年Zimmeran ,Jenkins ,Villena三个研究小组同时发现了 特异性水解甘油三酯的脂肪酶ATGL。人类ATGL基因(PNPLA2 )全长6.32kb，含10个外显子，定位于染色 体11p15.5，蛋白质分子量56kDa，共504个氨基酸。与鼠类有84%同源性。 根据ATGL序列的保守性和功能域可
11、将其分成A，B，C，D四段，N端序列A 中含有“patatin”结构域，为活性部位，含有显著的DG，MG和磷脂酶活性，但 无TG水解酶活性。人类基因组中有十个基因有patatin结构域，其中，以脂肪 营养蛋白(PNPLA3 )与ATGL的同源性最高，PNPLA3与肥胖密切相关。 ATGL的序列A ,除了 patatin结构域外，还有一a/B水解酶折叠式酯酶结构域 (此结构域常见于水解酶/酯酶)。具有特征性甘氨酸-X-丝氨酸-X-甘氨酸 (glycine-X-serine-X-glycine,GXSXG)共有顺序，亦称 GXSXG 基序，活性丝 氨酸位于47位，发挥丝氨酸酯酶作用，并可形成a/B
12、水解酶折叠。相同结构域 也可见于其余四种PNPLA蛋白和所有已知脂肪酶。由同源性的角度来说，166 位之天冬氨酸为第二个具有催化活性之氨基酸。序列 B,C,D 的功能尚未确定， 序列C中由第315至360之氨基酸为一段疏水区，可能有与脂肪或细胞膜结合 的位点。此区还有二个磷酸化作用部位，即丝氨酸 404 和 428。序列 B 和序列 D 功能仍不明确。异丙肾上腺素，肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor a, TNF-a)和胰岛 素可以减少ATGL mRNA表达，胰岛素的这种作用与ERK1/2通路活化有关。 儿茶酚胺类激素，TNF-a和胰岛素在肥胖和胰岛素抵抗个体均可出现浓度
13、升 高。在一项小鼠实验中，与正常小鼠相比，ATGL mRNA在ob/ob和db/db肥胖 小鼠中表达分别降低了 80%和50%。ATGL mRNA表达也受到空腹和进食的影 响。经空腹12 , 24和48小时观察，WAT中ATGL的mRNA量升高，12小 时达到峰值，然后逐渐下降， 48 小时回复到基础水平，重行摄食后 mRNA 进 一步降低。与 ATGL 同源的脂肪营养蛋白 mRNA 的表达则与 ATGL 相反，即 空腹时不表达而进食后大量表达。这表明 ATGL 主要功能是在空腹时脂解贮存 在脂肪中的甘油三酯，产生 FFA 供给能量。 ATGL 受过氧化物酶体增殖物激活 受体Y( PPAR 丫
14、)转录调控，采用PPAR Y激动剂罗格列酮显著增加脂肪组织 ATGL 转录水平和蛋白表达。而且，该蛋白表达水平与动物营养状态密切相 关：禁食明显增加表达，再行进食则使其表达水平回落。细胞实验表明，糖皮 质激素可剂量依赖的增加其表达，提示禁食时 ATGL 转录增加可能是体内糖皮 质激素增高所致。CGI-58 ( Comparative Gene Identification-58,又称a/B hydrolase domai n co ntai ning 5, ABHD5)属于a/B水解酶折叠家族蛋白，与脂滴 包被蛋白 perilipin 相互作用并共定位于脂滴表面。 Perilipin 具有双向
15、调控脂肪 分解的作用，是重要的脂滴相关蛋白。基础条件下，非磷酸化 perilipin 与 CGI- 58相结合，在PKA激活的脂肪分解过程中，CGI-58不再结合磷酸化perilipin, 并且从脂滴表面转位到包浆，特异活化 ATGL。 Perilipin 丝氨酸残基 517 位点 的磷酸化与ATGL活性密切相关。II型糖尿病的发病机理主要为胰岛素受体或受体后缺陷与胰岛素抵抗，从 而使胰岛素不能发挥其正常生理功能，以致血糖居高不下，而高血糖又继续 刺激胰岛素分泌，就形成高胰岛素血症，再加上脂肪代谢障碍，故II型糖尿病 患者初期的身型皆为肥胖。胰岛素增敏剂噻唑烷二酮类衍生物 -吡格列酮是常 用的
16、一类II型糖尿病治疗药物。其作用机制为：能增强骨骼肌、脂肪组织对葡萄 糖的摄取并降低它们对胰岛素的抵抗，降低肝糖原的分解，改善胰岛细胞对胰 岛素的分泌反应、B细胞功能、糖代谢和脂代谢，因而具有减少心血管危险因 素及延缓疾病进程的作用。吡格列酮对于脂代谢的改善作用表现在：其能激活 核转录因子PPARy来调控脂代谢有关基因的转录，从而促进脂肪细胞分化，清 除游离脂肪酸，增强脂肪酸氧化，调节血脂。ATGL为甘油三酯的主要代谢水 解酶，其表达是否受到吡格列酮调控呢？因而本实验以吡格列酮刺激3T3-L1脂 肪细胞，检测其对ATGL的表达的影响，借此探讨此种药物在治疗II型糖尿病同 时调节脂代谢的分子机制。1. 实验材料：3T3-L1 脂肪细胞（交通大学医学院生化与分子生物学系蔡蓉老师馈赠）， 细胞中性脂质油红0染色试剂盒（上海杰美基因医药科技有限公司），BCA蛋 白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术研究所），Western及IP细胞裂解液（碧 云天生物技术研究所） ，TRIzol Reagent（
