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1、这是鄂征的组织培养技术及其在医学研究中的应用中关于分裂淋巴细胞的方 法，可供参考。1. 概述：枸橼酸处理的全血，或加葡聚糖加速沉积去除红细胞的血浆，在 Percoll-Paque分层液上分出致密层。离心后，大多数淋巴细胞会积聚在 Ficoll/Metrizoate(Ficoll/甲泛葡胺)和血浆之间。2. 方法：(1) 枸橼酸或肝素抗凝血携入操作室或HOOD台面(2) 用PBSA按1： 1稀释，用9ml加入6mlPercoll-Paque分层液中进行分层，注入容量较大的、而且透明不带盖的离心管中，平衡(3) 400Xg离心15分钟(4) 在不干扰交界面情况下，小心去除血浆/PBSA(5) 用注
2、射器或吸管吸出交界面液体(吸时最好用钝圆针头或吸管，而不要用 尖的头吸(6) 用20ml不含血清培养液稀释(7) 从交界面来的稀释细胞悬浮，70g离心10分钟(8) 去掉上清，重悬沉积物于2ml不含血清培养液中；如果需要去掉血清中因 子，可用20ml无血清培养基反复漂洗、离心23次后，最后把沉积悬于2ml 不含血清培养基中(9) 取少许细胞样品，台盼蓝染色，细胞计数器检测含有核的细胞数(10) 接种入无血清或加血清培养基中培养注解：在第(3)步骤沉降中，淋巴细胞集中在杂有一些血小板和单核细胞的交 界面上，可能也有一些粒性白细胞。如欲获纯淋巴细胞，由于单核和粒性白血病 喜欢贴壁，可采用贴壁法进行
3、排除，如向悬液中置入无菌载物玻璃片，过一定时 间，这些细胞便可附着其上，抽出玻璃片弃掉；或把悬液注入培养瓶或皿中，在 镜下观察，过一定时间(1030分钟)，这些细胞如先贴附，而淋巴细胞尚处在 悬浮状态下，把悬液倒入另瓶中即可。当然也可应用更加复杂的方法如流式细胞 仪等分离亦可所有的细胞培养都应该坚守无菌操作原则2. 分层后的确有3层，准确说来是4层，最下面是红细胞，上面的一层不应该是 稍微混浊的白色，应该也比较透明，这一层上面就是我们需要的薄细胞层，最上 面是血清3. 细节：a. 淋巴细胞分离液要避光保存b. 就您的试验看来，淋巴细胞分离液的问题可能是最主要的c. 首先再离心管中加入淋巴细胞分离液，然后把标本缓慢加在淋巴细胞分离液表 面上，一定要缓慢小心操作，切不可混匀d. 所有操作都应在无菌环境进行e. 把离心管放入离心机是也应小心，不要太大幅度的摇幌离心管，当然离心后拿 出来也要小心就这么多了吧，这个操作是不是很难的，比较基本祝您好运了！补充两点：1. 淋巴细胞分离液在使用前需从4度冷藏取出室温平衡30min,没有此步操作易 导致分离失败.2. 全血的抗凝一定要充分,不然就会很难出现漂亮的白膜层.即你的（紧接着是一 层稍微混浊的白色大概有2CM）3. 离心转数一般为2000转,25min.尝试改进下,应该很容易分离的.
