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1、动物细胞原代培养-技术细节1、原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制、以及细胞的衰老，死亡等生命现象。2、传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。3、无菌操作基本技术:实验进行前，无菌室及无菌操作台（laminarflow）以紫外灯照射30-60分钟灭菌，以70%ethanol擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以7
2、0%ethanol擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70%ethanol擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面中央无菌区域，勿在边缘非无菌区域操作。小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自
3、人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台（至少ClassII）。操作过程中，应避免引起aerosol之产生，小心毒性药品，例如DMSO及TPA等，并避免尖锐针头之伤害等。定期检测下列项目：CO2钢瓶的CO2压力CO2培养箱的CO2浓度、温度、及水盘是否有污染（水盘的水用无菌水，每周更换）。无菌操作台内之airflow压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网（300小时/预滤网，3000小时/HEPA）。4、培养基液体培养基贮存于4冰箱，避免光照，实验进行前放在37水槽中温热。液体培养基（加血清）存放期为六个月，期间谷氨酰胺可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加
4、适量谷氨酰胺。粉末培养基配制（注意）：细胞培养基通常须添加10%血清、pH为-。粉末培养基及NaHCO粉末应分别溶解后才混合，然后用CO2气体调整pH,而非用强酸（HCl）或强碱（NaOH）,因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的pH易发生改变。纯水配制。以或mm无菌过滤膜过滤灭菌。标示培养基种类、日期、瓶号等，贮存于4。须作生长试验与污染测试。5、抗生素.细胞库之细胞培养基不加抗生素培养自ATCC引进之细胞株，培养基中不加抗生素。培养自其它实验室引进之细胞株，须添加抗生素，待tokenfreeze通过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。.寄送活细胞时，须将培养液充满整个培养瓶时，则
5、须添加抗生素（青霉素100units/ml+链霉素100ug/ml）。.若要检测支原体，则培养基内不可添加庆大霉素，因庆大霉素会抑制支原体生长。6、血清：-20C或-70C至4c冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般以50ml无菌离心管可分装4045ml。在溶解过程中须规则摇晃均匀（小心勿造成气泡），使温度与成分均一，减少沈淀的发生。勿直接由-20c直接至37c解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。7.血清之沈淀物.凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白（lipoprotein）变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白（fibrin）造成，这些凝絮沈淀物不会影响血清
6、本身之品质。显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，一般而言，此小黑点应不会影响细胞的生长。8、细胞冷冻保存注意事项：.欲冷冻保存之细胞应在生长良好且存活率高之状态，约为80-90%致密度。.冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。.注意冷冻保护剂之品质。DMSO为试剂级等级，无菌且无色以510ml小体积分装，4避光保存，勿作多次解冻。甘油亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。9、冷冻细胞活化：1.快速解冻
7、（轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化），以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。2.细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常（例如产生单株抗体或是其它蛋白质）。解冻后是否立即去除冷冻保护剂（例如DMSOEglycerol）,依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。在解冻培养后隔日更换培养基大格*细胞总数x2x104/4=细胞数/ml1 冷冻管应如何解冻取出冷冻管后，须立即放入37C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂
8、。2 细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除DMSO除少数特别注明对DMSCK感之细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSOB可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。3 可否使用与原先培养条件不同之培养基不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种
9、的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。5 何谓FBS,FCS,CS,HSFBS(fetalbovineserum)和FCS(fetalcalfserum)是相同的意思，两者都是指胎牛血清，FCS乃错误的使用字眼，请不要再使用。CS(calfserum)则是指小牛血清。HS(horseserum)则是指马血清。6培养细胞时应使用5%或10%CO2E根本没有影响一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作为pH的缓冲系统，而培养基中NaHCO3勺含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。当培养基中NaHCO给量为每公升g时，细胞培养时应使用10%C
10、O2当培养基中NaHCO纵每公升g时，则应使用5%CO2培养细胞。7 何时须更换培养基视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。8 培养基中是否须添加抗生素除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。9 附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA浓度应如何处理一般使用之trypsin-EDTA浓度为%。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于-200C,避免反复冷冻解冻造成trypsin之活性降低，并可减少污染之机会。10 悬浮性细胞应如何继代处理一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，稀释细胞浓度即可，若培养液太多时，可
11、将培养角瓶口端稍微抬高，直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复前述步骤即可。11 欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速欲回收动物细胞，其离心速率一般为300xg(约1,000rpm)，5-10分钟，过高之转速，将造成细胞死亡。12 细胞之接种密度为何依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。13 细胞冷冻培养基之成份为何动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5-10%DMSO(dimethylsulfoxide)和90-95%原来细胞生长用之新鲜
12、培养基均匀混合之。注意：由于DMSCft释时会放出大量热能，故不可将DMSOft接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成。14 DMSO之等级和无菌过滤之方式为何冷冻保存使用之DMSB级，必须为Tissueculturegrade之DMSO如SigmaD2650)，其本身即为无菌状况，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于4C,避免反复冷冻解冻造成DMSO裂解而释出有害物质，并可减少污染之机会。若要过滤DMSO则须使用耐DMSONylon材质滤膜。15 冷冻保存细胞之方法冷冻保存方法一：冷冻管置于40C3060分钟(-200C30分钟*)-80C1618小时(或隔夜)-液氮槽vaporp
13、hase长期储存。冷冻保存方法二:冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3C至-80C以下，再放入液氮槽vaporphase长期储存。*-200C不可超过1小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80C冰箱中，惟存活率稍微降低一些。适用于悬浮型细胞之保存。16 细胞欲冷冻保存时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度冷冻管内细胞数目一般为每瓶1x106cells/ml，融合瘤细胞则以每瓶5x106cells/ml为宜。17 应如何避免细胞污染细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。
14、严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。18 如果细胞发生微生物污染时，应如何处理加入相应抗生素。直接灭菌后丢弃之。19 支原体（mycoplasma）污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。20 支原体污染会对细胞培养有何影响支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。21 侦测出细胞株有支原体污染时，该如何处理直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。22 CO2培养箱之水盘如何
15、保持清洁定期（至少每两周一次）以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。23为何培养基保存于40C冰箱中，颜色会偏暗红色，且pH值会越来越偏碱性培养基保存于40C冰箱中，培养基内之CO2会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂（通常为phenolred）的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果，将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时，可以通入无菌过滤之CO2，以调整pH值。24 各种细胞培养用的dish，flask是否均相同不同厂牌的dish或flask，其所coating的polymer不同，制造程序亦不同，虽对大部分细胞没有太大之影响，惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish或flask而有显著之生长差异。25 购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少，大都是因为离心过程操作上的失误，造成细胞的物理性损伤，以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心，应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。26 购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因研究人员在细胞培养时出现存活
