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1、抗菌肽生产关键技术及其产业化吴松刚 施巧琴 郑 毅 黄建忠（福建师范大学工业微生物发酵技术国家工程研究中心 福州 350108）赵燕玉 蔡玉凤 孙 艳 黄钦耿 （福建省麦丹生物集团有限公司福州研究院 福州 350107）1.0 技术背景抗菌肽具有多种功效，可替代对人类健康有危害的抗生素和抗菌类药物在饲料中添加，是理想的无毒、无残留、高效广谱、抗菌，促生长的绿色饲料添加剂，被认为是抗生素的理想替代品。目前我国采用高效抗菌肽生产菌株，使用优化发酵工艺，配合低温干燥技术，生产具有高效价的抗菌肽产品。随着社会的发展和人们的生活水平提高，更多的人越来越关心食物的安全和健康问题，无污染、无残留和无公害的安
2、全绿色食品已逐步成为人们一种新的消费追求。饲料添加剂是生产饲料的源头之一，其质量直接影响饲料的质量，而饲料的质量又直接影响到畜禽的质量，所以要生产出绿色安全的畜禽产品，就必须严把饲料添加剂的质量和安全关。目前，所有的常规抗生素都出现了相应的抗药性致病株系，致病菌的抗药性问题已经日益严重地威胁着人们的健康。随着抗生素的大量广泛用于饲料中和人们对食品和环境质量的要求越来越高，人们对抗生素的副作用认识日益加深，抗生素在饲料业中的应用，已面临着淘汰或禁用的局面。从2006年4月1日开始，欧盟已禁止在饲料中添加抗生素类饲料添加剂。许多国家对抗生素、化学合成药品的使用、淘汰、畜产品中的药物残留作了非常严格
3、的限定，并致力于开发和推广无害的绿色饲料添加剂，以生产出安全可靠的食品“绿色畜产品”，来满足人们的需求。人们正从天然物质中寻找理想的无毒、无残留、高效广谱、抗菌促生长的绿色饲料添加剂，并应用于养殖生产。我国也已经开始限制抗生素在饲料中的添加和用量，应用无毒无公害的新型抗菌剂代替抗生素作饲料添加剂，已成为当前国内外饲料学科的一项重要内容。随着我国进入WTO，抗生素作饲料添加剂必将严重影响畜产品在国际市场的竞争力，借助生物高科技的最新成果，研发对环境友好型的、绿色环保的多肽类生物添加剂及抗生素替代剂，彻底扭转和杜绝滥用抗菌素和激素类添加物的问题，是提高人类健康水平、促进生产和生活质量需要迫切解决的
4、课题。抗菌肽( Antibacterial peptide) 又叫抗微生物肽(Antimicrobial peptide) 、抗生素肽(Antibiotics peptide) 。抗菌肽是生物细胞特定基因编码产生的一类小分子多肽, 其生成和释放是机体炎症反应的组成部分, 是宿主防御病原微生物入侵的重要分子屏障。抗菌肽具有分子量低、水溶性好、热稳定、强碱性和广谱抗菌等特点, 愈来愈受到重视, 研究已深入到分子结构和作用机制等多个方面。抗菌肽最初是Boman 从天蚕的免疫血淋巴中纯化, 而后又在哺乳动物、鸟类、植物以及细菌中发现。时至今日, 发现的抗菌肽大约有800 多种。微生物来源的抗菌肽是抗菌
5、肽家族中的重要一员, 它能特异性杀死竞争菌而对宿主本身无害,包括环形肽、糖肽和脂肽, 如短杆菌肽、杆菌肽、多黏菌素和乳酸链球菌肽等。如Lantibiotic 是革兰阳性菌产生的抗菌肽, 乳链菌肽nisin 是其中研究最为清楚的lantibiotic 类抗菌肽。一些由真菌产生的抗菌肽, 如哌珀霉素类( peptaibol) 抗菌肽, 主要由木霉属土壤真菌产生。随着人类对抗菌肽研究的进一步深入, 近年,不断从微生物中发现和提取具有抗菌活性的肽类物质。我国抗菌肽生产菌株普遍采用枯草芽孢杆菌，其产生的是一种混合多肽, 由于结构上很相似,各个成分极难分开。已报道的杆菌肽组分有A, A ,B, C, D,
6、 E, F, F1, F2, F3, G 等。A 组分是其中生物活性最高也是最重要的组分, 通常称之为杆菌肽Gramicidina, 分子式为C66H103N17O16S, 其结构是由12个氨基酸组成的多肽。具有环状结构, 分子中含有D-和L-氨基酸。对各种蛋白质水解酶如胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和无花果蛋白酶等具有很大的抗性, 也不受蛋白酶抑制剂的影响。与其它抗生素比较, 这是一个优点。如果把杆菌肽制成锌盐或亚甲基水杨酸盐, 就比天然产品要稳定得多。杆菌肽对多种革兰氏阳性病原菌, 如葡萄球菌、溶血性链球菌、微型球菌、藤黄八叠菌、非溶血性链球菌、魏氏梭菌、放线菌以及部分革兰氏阴性菌均有较强
7、抑制作用。杆菌肽的作用机理是由于能抑制细胞壁所合成的脱磷化过程, 影响磷脂载体的转运及向细胞壁支架输送粘肽, 从而抑制细胞壁的合成; 另一方面是与敏感菌的细胞膜结合损伤细胞膜使细胞膜的通透性增加导致内粘质外流; 其次是干扰敏感菌细胞内原浆蛋白的合成。抗菌肽通过摧毁细菌的细胞膜起杀灭作用近年来, 杆菌肽制剂在动物饲料添加剂上的应用取得了巨大的成功, 杆菌肽锌( Bac-itracin Zine)被美国首先批准作饲料添加剂使用以来, 已为各国批准使用。因其抑菌促生性能良好,比较安全可靠, 成为发展最快、应用最广的新型饲料添加剂。我国已于1990 年批准生产与使用国内产品。2.0 抗菌肽生产关键技术
8、2.1 高效价抗菌肽菌株的筛选在从昆虫及试样中分离出产抗菌肽的细菌菌株共156株,经鉴别其中:短杆菌48株、芽孢杆菌66株及乳酸链球菌42株,在初筛过程中，发酵效价在5000 /ml以上者有36株，其中：短杆菌8株、芽孢杆菌22株及乳酸链球菌6株,经复筛有15株发酵效价在5000/ml以上，均为枯草芽孢杆菌，以T-1045为最高达10453.3/ml，其次为T-1278，T-2856及T-3033均达9926.6 /ml。表1 高效价抗菌肽菌株的筛选结果之一菌号ODpH效价（/ml）菌落形态T-10080.215 5.54 6915.9较大0.216 5.49 0.214 5.53 T-104
9、30.244 5.50 6916.90.226 5.49 0.223 5.52 T-10450.215 5.63 10453.30.213 5.62 0.213 5.62 T-12110.219 5.43 8952.80.227 5.53 0.207 5.54 T-12780.241 5.48 9926.60.216 5.55 0.226 5.51 T-12980.234 5.54 7668.2中等0.240 5.53 0.244 5.52 T-13440.235 5.52 5073.60.258 5.53 0.252 5.52 T-15760.264 5.54 7668.20.239 5.5
10、6 0.236 5.52 表2 高效价抗菌肽菌株的筛选结果之二T-15880.243 5.44 7556.4较小0.233 5.51 0.240 5.50 T-15920.245 5.51 7668.20.252 5.50 0.246 5.51 T-18790.238 5.49 7668.20.226 5.60 0.235 5.49 T-19660.257 5.52 7668.20.236 5.56 0.272 5.49 T-28560.247 5.55 9926.60.245 5.62 0.238 5.66 T-29360.266 5.49 8952.80.262 5.47 0.244 5.
11、47 T-30330.242 5.44 9926.60.255 5.44 0.249 5.44 2.2 T-1045菌株种子及发酵培养基优化2.2.1 T-1045菌株种子培养基配方四因素七水平均匀法设计方案表3 种子培养基配方四因素七水平均匀法设计方案（%）因子蔗糖糖蜜玉米浆粉硫酸铵N12.004.202.200.50N22.603.802.000.65N31.804.000.900.70N41.404.801.500.60N52.203.001.300.55N62.404.401.100.45N71.603.401.700.402.2.2 T-1045菌株种子培养基配方四因素七水平均匀法实
12、验结果表4 四因素七水平均匀法实验结果之一项 目N116h20h24hODpHODpHODpH0.3066.280.3197.340.2907.94N20.2886.220.3356.380.3067.91N30.3436.020.2885.810.3237.05N40.2546.050.2887.280.2927.60N50.2585.990.3286.910.3567.29N60.2766.120.2936.030.3517.08N70.2716.110.2727.620.2717.53表5 四因素七水平均匀法实验结果之二配方配方编号培养时间培养基成份蔗糖糖蜜玉米浆粉硫酸铵种子配方N-31
13、6h 1.804.000.900.70N-161.404.762.20.70N-220h 2.603.802.000.65N-202.604.802.20.70N-520h和24h 2.203.001.300.55N-2424h2.584.000.90.51发酵配方（一）25h3.505.30 0.84 0.60 注：N16、N20、N24分别为16h、20h、24h理论拟合结果表6 四因素七水平均匀法实验结果之三种子培养时间配方编号OD*50pHOD*100pH效价(/ml)16h种龄N-30.2865.810.194 6.01 83330.204 5.94 0.198 5.87 N-160.3067.160.186 6.13 85760.186 6.14 0.191 6.11 20h种龄N-20.3247.560.212 5.93 84760.182 5.90 0.212 5.94 N-50.2957.150.210 6.32 93040.204 6.37 0.207 6.44 N-200.3626.560.176 5.96 116670.201 5.89 0.202 5.92 24h种龄N-50.326.720.185 6.33 91060.175 6.41 0.1
