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1、人抗胰岛素受体抗体(AIRA)酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用产品编号：CSB-E09568h检测范围： 3.12 U/ml - 200 U/ml最低检测限： 0.78 U/ml 特异性：本试剂盒可同时检测天然或重组的人AIRA，且与其他相关蛋白无交叉反应。 有效期： 6 个月预期应用： ELISA 法定量测定人血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中 AIRA 含量。说明1. 试剂盒保存：-20C(较长时间不用时)；2-8C(频繁使用时)。 2浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。3. 中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。4. 刚开启的酶
2、联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造 成任何影响。实验原理用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗AIRA抗体的微孔中依次加入标本 或标准品、生物素化的抗AIRA抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显 色。 TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的 深浅和样品中的AIRA呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样 品浓度。试剂盒组成及试剂配制1. 酶联板(Assay plate ):一块(96 孔)。2. 标准品( Standard)：2 瓶(冻干品)。3. 样品稀释液(Sample D
3、iluent)： 1x20ml/瓶。4. 生物素标记抗体稀释液(Biotin-antibody Diluent): 1x10ml/瓶。5. 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液(HRP-avidin Diluent)： 1x10ml/瓶。6. 生物素标记抗体(Biotin-antibody): 1x1201/瓶(1： 100)7. 辣根过氧化物酶标记亲和素(HRP-avidin)： 1x1201/瓶 (1： 100)8. 底物溶液(TMB Substrate)： 1x10ml/瓶。9. 浓洗涤液(Wash Buffer)： 1x20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。10. 终止液(Stop S
4、olution)： 1x10ml/瓶 (2N H2SO4)。需要而未提供的试剂和器材1. 标准规格酶标仪2. 高速离心机3. 电热恒温培养箱4. 干净的试管和 Eppendof 管5. 系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器6. 蒸馏水，容量瓶等 标本的采集及保存1.血清：全血标本请于室温放置2小时或4C过夜后于1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20C或-80C保存，但应避免反复冻融。2. 血浆：可用 EDTA 或肝素作为抗凝剂，标本采集后 30 分钟内于 2 - 8 C 1000 x g 离心 15分钟，或将标本放于-20C或-80C保存，但
5、应避免反复冻融。3. 细胞培养物上清或其它生物标本：1000 x g 离心 20 分钟，取上清即可检测，或将标本 放于-20C或-80C保存，但应避免反复冻融。注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。 标本的稀释原则： 首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量，确定适当的稀释倍数。只有稀释至标准 曲线的范围内，检测的结果才是准确的。稀释的过程中，应做好详细的记录。最后计算浓度 时，稀释了“N”倍，标本的浓度应再乘以“N”。标准品的稀释原则：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至lml,盖好后静置10分钟以上， 然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为200 U/ml,做系列倍
6、比稀释后，分别稀释200 U/ml,100 U/ml，50 U/ml，25 U/ml，12.5 U/ml，6.25 U/ml，3.12 U/ml,样品稀释液直接作为标准 浓度0 U/ml,临用前15分钟内配制。如配制100 U/ml标准品：取0.5ml （不要少于0.5ml） 200 U/ml的上述标准品加入含0.5ml 样品稀释液的 Eppendorf 管中，混匀即可，其余浓度以此类推。生物素标记抗体的稀释原则： 临用前以生物素标记抗体稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100卩1）,实际配制时应多配制0.1-0.2ml。女口 10卩1生物素标记抗体加990卩1生物
7、素标 记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则：临用前以辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的 总量配制（每孔100卩1）,实际配制时应多配制0.1-0.2ml。女口 10卩1辣根过氧化物酶标记亲和 素加990卩1辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内 配制。操作步骤实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。 每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试 剂盒的检测范围。1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待
8、测样品孔。空白孔加样品稀释液100卩1，余孔分别加 标准品或待测样品100卩1，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触 及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37C反应120分钟。 为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液100卩1 （取1卩1生物素标记 抗体加99卩1生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制）， 37C,60 分钟。3. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，3501/每孔，甩 干。4. 每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（同生物素标记抗
9、体工作液）100卩1, 37C, 60 分钟。5. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，3501/每孔，甩 干。6. 依序每孔加底物溶液90卩1, 37C避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4 孔有明显的梯度蓝色，后 3-4 孔梯度不明显，即可终止）。7. 依序每孔加终止溶液50 M，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量 与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入 终止液。8. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后15分钟以内 进行检测。注：1. 用户在初次使用试剂盒时，
10、应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。2. 每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是最后加底物溶液及2N H2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。3. 为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜。4. 未使用完的酶标板或者试剂，请于2-8C保存。标准品、生物素标记抗体工作液、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的标准 品、生物素标记抗体工作液或、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液。5. 建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。洗板方法 手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台
11、上铺垫几层吸水纸， 酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3m 1注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需 要，重复此过程数次。自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。计算以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上绘 出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物 的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样 品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。注意事项1. 当混合蛋白溶液时应尽量轻缓，避免起泡。2. 洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。3. 一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。4. 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。5. 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。6. 在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。7. 底物请避光保存。8. 不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。
